小麦对氮限制耐受性的差异形态-生理和植物激素谱和基因组表达谱

编译：微科盟伊一，编辑：微科盟景行、江舜尧。

导读

普通小麦（TriticumaestivumL.）是全球的主食，而氮（N）限制严重阻碍了小麦的植株生长、种子产量和籽粒品质。异源六倍体小麦（AABBDD，2n=6x=42）基因型对低氮胁迫反应的遗传变异强调了低氮耐受性和氮利用效率（NUE）背后复杂的调控机制。本研究采用水培法、电感耦合等离子体质谱法、无创微量检测法、高效液相色谱法、RNA-seq和生物信息学方法确定了高氮和低氮条件下生长的小麦植株的不同生长表现、离子组和植物激素谱以及全基因组表达谱。NPFs、NRT2s、CLCs、SLACs/SLAHs、AAPs、UPSs、NIAs和GSs的转录谱分析确定了参与硝酸盐和有机氮养分高效运输和同化的核心成员，如、、TaNIA1-6B、TaGLN1;2-4B、TaAAP14-5A/5D和TaUPS2-5A。在氮限制条件下，低氮敏感性小麦栽培品种XM26表现出明显的叶片萎黄，ABA、JA和SA的积累水平高于低氮耐受性ZM578。本研究提出，/模块介导的硝酸盐从芽到根的转运和叶片再动员是调节ZM578和XM26对低氮反应差异的重要途径。

论文ID

原名：DifferentialMorpho-Physiological,Ionomic,andPhytohormoneProfiles,andGenome-WideExpressionProfilingInvolvingtheToleranceofAllohexaploidWheat(TriticumaestivumL.)toNitrogenLimitation

译名：异源六倍体小麦对氮限制耐受性的差异形态-生理、经济学和植物激素谱和全基因组表达谱

期刊：JournalofAgriculturalandFoodChemistry

IF：6.1

发表时间：2024年2月

通讯作者：华营鹏，Peng-jiaWu

DOI号：10.1021/

实验设计

结果

1六倍体小麦植株对氮缺乏的形态生理学反应

研究者通过在高浓度（6.0mM）和低浓度（0.30mM）NO3-条件下水培，测定了“中国春”对氮限制的生理反应。植物生长20天后，长期氮限制显著影响了“中国春”的芽和根的生长（图1A）。低氮诱导了“中国春”主根的伸长（图1B），而叶片则严重萎黄，SPAD值明显降低（图1C）。在低氮条件下，“中国春”的根总长度（图1D）、根表面积（图1E）和根尖数（图1H）都比高氮条件下显著增加。然而，在低氮条件下，“中国春”的平均根径比高氮条件下有所减少（图1F），而根量在两种氮水平下没有显著变化（图1G）。此外，研究者还检测了几种金属离子的浓度分布，包括K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn和Na，以探讨氮引起的生长变化（图1I-P）。与高氮条件下相比，低氮条件下生长的小麦植株中这些阳离子的浓度发生了显著变化（图1I-P）。具体而言，在缺氮条件下，芽中K、Cu和Zn的浓度明显降低，而其他阳离子的浓度未发现明显差异。在根部，除了Mn的浓度明显降低外，其他阳离子（即K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn和Na）的浓度在低氮条件下都明显增加。

为了确定低氮O3-条件对其他离子动态通量的影响，研究者使用无创微量检测技术测量了中国春小麦主根中NO3-与H+、K+和Ca2+的净流入量。结果表明，在高氮条件下生长的小麦植株根系中，NO3-的流入率要强于低氮条件下（图2A,B）。此外，研究者还发现高氮条件下生长的“中国春”比低氮条件下生长的“中国春”的NO3-流入量表现出更明显的周期性波动（图2A,B）。在低氮条件下，两种阳离子的动态通量和净通量都明显小于高氮条件下（图2C-F），这与“中国春”根系中K和Ca浓度降低的结果一致（图1I,J）。NO3-的流入量受质膜上H+梯度的驱动；在低氮条件下，研究者发现与高氮条件下相比，“中国春”根系中H+外流的增加幅度更大（图2G,H）。

图1.高氮和低氮条件下小麦植株的生长表现、根系结构和离子组学特征。(A-H）在高氮和低氮条件下生长的小麦植株（）的生长表现（A）、动态主根生长状况（B）、SPAD值（C）、根系总长度（D）、根系表面积（E）、根系平均直径（F）、根系体积（G）和根尖数量（H）。(I-O）在高氮和低氮条件下生长的小麦植株的K（I）、Ca（J）、Mg（K）、Fe（L）、Mn（M）、Cu（N）、Zn（O）和Na（P）浓度。在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下水培20天，直至取样。数据以平均值（n=5）±表示。两组间的显著差异（*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001）由使用工具包进行的非配对双尾学生t检验确定。

2全基因组六倍体小麦植株对氮限制的转录响应

研究者在剔除适配序列和低质量读数后，平均每个样本获得约4.9×107个纯净读数，纯净读数总长度达到约8.5×1010nt，Q20＞97%，Q30＞92%（表S1）。总体而言，12个小麦植株RNA样本的GC含量约为58%（表S1）。在每个样本中，94%的干净读数被映射到“中国春”的参考转录组序列（表S1）。

总之，在高氮和低氮条件下，“中国春”的芽和根表现出明显不同的转录组特征（图S2A），表明氮水平依赖性转录反应。每对生物重复之间的皮尔逊相关系数大多大于0.95（图S2B）。研究者随机选择了10个DEGs，比较它们在RT-qPCR检测和转录组测序之间的表达一致性。大多数基因的表达在两种检测方法之间高度相关（r＞0.99）（图S1）；这两个结果表明mRNA测序数据质量良好。总体而言，在芽和根中分别发现了6696和8537个差异表达基因（图S2C）。韦恩图显示的交叉分析表明，在芽和根中同时检测到了1751个DEGs（图S2C）。

在“中国春”的芽和根中，高富集的GO项主要与硝酸盐转运和代谢以及对植物激素（包括JA、GA和SA）的响应有关（图S3A,B）。一致的是，芽中的光合作用和根中的苯丙类化合物生物合成是最活跃的KEGG通路（图S4A,B），而氮代谢通路在芽和根中的代表性普遍偏高（图S4A,B）。

图2.高氮和低氮条件下小麦幼苗主根中NO3-与K+、Ca2+和H+的动态流入量和净流入量。NO3-（A，B）、K+（C，D）、Ca2+（E，F）和H+（G，H）的动态流入量和净流入量。正负数据分别表示离子的流出率和流入率。数据以平均值（n=8）±表示。两组间的显著差异（*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001）由使用工具包进行的非配对双尾学生t检验确定。

3与氮转运和氮限制代谢有关的核心基因的转录特征

拟南芥基因组中共注释了53个NRT1s/NPFs、7个NRT2s、5个SLACs/SLAH和7个CLCs；这些转运体在作物物种中大量扩增，尤其是那些基因组复杂且庞大的物种（如油菜和普通小麦）。然而，在本研究之前，异源六倍体小麦的核心氮转运体基因仍不为人知。研究者通过对硝酸盐转运体基因的转录谱分析（表S2），发现在高氮和低氮条件下生长的“中国春”小麦中，不同成员的表达模式（包括表达组织和丰度）存在显著差异（图3）。在差异表达的TaNPF成员中，的几个同源物表达水平最高；它们主要在根部表达，在高氮条件下的转录丰度高于低氮条件下（图3A），表明它们在高氮条件下对NO3-转运的亲和力较低。总的来说，所有的TaNRT2s都主要在根部表达；其中，3个同源物（/B/D）在低氮条件下的表达显著上调，并表现出最高的表达水平（图3B）。在4个TaNAR2DEGs中，它们在低浓度氮条件下均出现下调（图3C）。不同的TaSLAC/SLAH成员对低氮表现出不同的反应，低氮诱导TaSLAH2-1A的表达，抑制TaSLAH2-1B1的表达（图3D）。在CLC同源物中，TaCLCb-6D2在芽和根中的转录丰度最高，并受到高氮的诱导（图3E）。

图3.在高氮（N）和低氮条件下生长的小麦植株的芽和根中一些硝酸盐转运体基因的差异表达分析。(A-E）硝酸/肽家族（NPF）、硝酸转运体2（NRT2）、硝酸同化相关2（NAR2）、慢型阴离子通道（SLAC/SLAH）和氯离子通道（CLC）在高氮和低氮条件下小麦植株芽和根中的差异表达。在RNA-seq实验中，分别对在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下生长20天的小麦植株（）的芽和根进行取样。假发现率（FDR）≤0.05和log2（折合变化）≥1.0是识别DEGs的阈值。C，对照（高氮）；T，处理（低氮）；S，芽；R，根。

总之，全基因组差异表达谱分析为筛选候选精英基因提供了宝贵的信息，通过对这些基因进行分子改造，可对异源六倍体小麦氮的高效利用进行遗传改良。

图4.在高氮和低氮条件下生长的小麦植株的芽和根中一些氮（N）同化基因、有机氮转运体基因和关键NUE调节基因的差异表达分析。(A-E）硝酸还原酶（NIA）、谷氨酰胺合成酶（GLN）、氨基酸渗透酶（AAP）、尿苷渗透酶（UPS）、其他有机氮转运体、自噬相关基因（ATG）和氮限制适应基因（NLA）在高氮和低氮条件下小麦植株芽和根中的差异表达。在RNA-seq实验中，分别对在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下生长20天的小麦植株（）的芽和根进行了取样。假发现率（FDR）≤0.05和log2（折合变化）≥1.0是识别DEGs的阈值。C，对照（高氮）；T，处理（低氮）；S，芽；R，根。

4耐低氮和低氮敏感小麦基因型对氮缺乏的形态生理学反应差异

中度低氮条件可提高作物的氮利用效率；因此，提高耐低氮能力对提高氮利用效率极为重要。在本研究中，研究者发现在高氮条件下，耐低氮小麦品种ZM578和对低氮敏感的小麦品种XM26在芽和根的生长表现上没有明显差异；但与ZM578相比，XM26的老叶明显萎黄，而ZM578的根则更为强壮（图5A,B）。具体来说，在氮限制条件下，ZM578的叶片SPAD值和最大根长明显高于XM26（图5C,D）。为了明确ZM578和XM26对氮限制耐受性不同的生理原因，研究者首先测定了芽和根中总氮和NO3-的浓度。结果表明，两种小麦基因型的芽和根的总氮浓度没有差异（图5E,F），这表明两种小麦基因型对氮的耐受性差异与氮的吸收无关。此外，根[总氮]/芽[总氮]的比例在ZM578和XM26之间也非常相似（图5G）。随后，研究者检测了NO3-的浓度；在低氮条件下，XM26根部NO3-的浓度显著高于ZM578（图5I），而两个栽培品种芽部的NO3-浓度没有差异（图5H）。此外，耐低氮栽培品种ZM578的根[总NO3-]/芽[总NO3-]比XM26更低（图5J），这表明ZM578中从根到芽的长距离NO3-转化比例更高。此外，研究者还发现，XM26的芽中Ca/Zn和根中Fe的浓度显著高于ZM578，而其他阳离子在芽或根中的浓度在两个栽培品种之间没有差异（图5K-R）。

图5.耐低氮小麦基因型和低氮敏感小麦基因型对氮素缺乏的形态生理反应差异。(A、B）在高氮和低氮条件下，耐低氮栽培品种中麦578（ZM578）和对低氮敏感的小麦栽培品种新麦26（XM26）的整株（A）和老叶（B）的生长表现概览。(C-R）叶片SPAD值（C）、最大根长（D）、芽中总氮（E）、根中总氮（F）、根[总氮]/芽[总氮]之比（G）、芽中总NO3-（H）、根中总NO3--（I）、根[NO3-]/芽[NO3-]之比（J）、以及耐低氮栽培品种ZM578和低氮敏感小麦栽培品种XM26在高氮和低氮条件下老叶中K（K）、Ca（L）、Mg（M）、Fe（N）、Mn（O）、Cu（P）、Zn（Q）和Na（R）的浓度。均匀的小麦幼苗在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下水培20天直至取样。两组间的显著差异（*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001）由使用工具包进行的非配对双尾学生t检验确定。

5耐低氮小麦基因型和对低氮敏感小麦基因型的差异基因表达谱分析

为了探索不同耐低负性的潜在分子机制，研究者使用IlluminaHiSeq4000系统对低氮耐受性ZM578和低氮敏感的XM26进行高通量转录谱分析。去除适配序列和低质量读数后，每个样本平均获得超过4.7×107个干净读数，干净读数总长度达到1.3×1010nt，Q20和Q30的碱基调用准确率分别超过98%和95%（表S3）。总体而言，本研究中24个ZM578和XM26RNA样本的GC含量约为55%。在每个样本中，90%的干净读数被映射到了“中国春”的参考转录组序列上。

研究者在低氮条件下生长的ZM578和XM26的芽和根中分别发现了30647和31107个DEGs（图6A）。为了确定对低氮有特异响应的基因，研究者进行了韦恩图介导的交叉分析；在芽和根中分别唯一鉴定出4013和3288个DEGs，其中557个DEGs常见于这两种器官（图7B）。PCA结果显示，不同氮水平、小麦基因型和器官表现出显著不同的转录组特征（图6B）。值得注意的是，在低氮条件下，芽和根的转运体活性、膜和对刺激的反应等GO项都高度富集（图6C）。研究者对全基因组DEGs的KEGG分析表明，除了在芽和根中普遍发现的硝酸盐转运外（图6D,E），在低氮条件下小麦植株根中还发现了有机氮营养物质（如胺和氨基酸）的转运和代谢特征（图6F）。

图6.在高氮和低氮条件下生长的耐低氮和低氮敏感小麦幼苗的转录组测序比较数据概览。(A-F）高氮和低氮条件下生长的小麦植株芽（E）和根（F）全基因组差异表达基因（DEGs）的数量（A）、韦恩图介导的交叉分析（B）、主成分分析（C）、GO富集分析（D）和KEGG通路富集分析。H，高氮；L，低氮；S，芽；R，根。实心圆圈大小代表通路富集程度。圆圈越大，对应的KEGG项目越多。关于RNA-seq实验，小麦植株分别在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下生长20天，直到芽和根分别取样。以假发现率（FDR）≤0.05和log2（折合变化）≥1.0作为识别DEGs的阈值。

首先，研究者研究了一些植物激素，即IAA、GA、ABA、JA、SA、BR、tZ、cZ、tZR、2-iPA和BR在耐低氮栽培品种ZM578和低氮敏感栽培品种XM26之间的芽和根中的浓度分布及其表达谱（图7）。在这些植物激素中，最值得注意的是ABA、JA和SA。XM26的芽ABA、根JA和SA浓度明显高于ZM578（图7A）。根据参与这三种植物激素生物合成的基因（图7B），研究者发现参与SA生物合成的TaPBSs和TaEPSs、参与JA生物合成的TaLOXs和参与ABA生物合成的TaADHs在XM26中的表达水平高于ZM578（图7C-E）。

图7.在高氮和低氮条件下生长的低氮耐受基因型ZM578和低氮敏感基因型XM26的芽和根中植物激素浓度曲线和涉及植物激素生物合成的基因转录曲线。(A）植物激素浓度曲线，（B-E）生物合成途径（B）ZM578和XM26芽和根中涉及ABA（C）、JA（D）和SA（E）生物合成的全基因组基因转录曲线。H，（高氮）；L，低氮；S，芽；R，根。ABA，脱落酸；BR，油菜素内酯；cZ，顺式玉米素；GA，赤霉素；IAA，吲哚-3-乙酸；IBA，吲哚-3-丁酸；iP，异戊烯基腺嘌呤；JA，茉莉酸；SA，水杨酸；tZ，反式玉米素；tZR，反式玉米素核苷。AAO，脱落酸醛氧化酶；ADH，醇脱氢酶；AOC，氧化烯环化酶；AOS，氧化烯合成酶；LOX，脂氧合酶；NCED，9-顺式环氧类胡萝卜素二氧合酶；OPR，12-氧代-phytodienoicacid还原酶；PLA1，磷脂酶A1；ZEP，玉米黄质环氧化酶；ZSY，新黄质合成酶。关于RNA-seq和植物激素检测实验，小麦植株在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下生长了20天，直到嫩芽和根部分别取样。以假发现率(FDR)≤0.05和log2（折合变化）≥1.0作为阈值来识别DEGs。

考虑到根-芽NO3-易位差异是小麦基因型间耐低氮差异的主要原因（图5J），研究者提出负责根木质部NO3-负载的/是导致耐低氮差异的候选基因。根据比较转录组测序数据，研究者发现了两个/，其中/（最新ID：TraesCS6D03G0593500；原始ID：TraesCS6D02G251500）受低氮的强烈诱导，在ZM578根中的表达水平显著高于XM26（图8A）。

CLCa和CLCb是负责液泡NO3-流入和流出的重要转运体。在低氮条件下，CLCa的表达减少和CLCb的表达增加有助于NO3-从根到芽的长距离高效转运，而这是由/的表达增加承担的。因此，研究者研究了ZM578和XM26根系中TaCLCa和TaCLCb的表达情况；结果发现，与低氮敏感栽培品种XM26相比，耐低氮栽培品种ZM578的TaCLCa-6A表达量较低，而TaCLCb-6D表达量较高，尤其是在氮限制条件下（图8B）。研究者还发现，氮同化基因，尤其是TaNIA1-7D/TaNIA1-6D和TaGLN1;2-4D/TaGLN1;2-4D，在ZM578中的表达水平明显高于XM26（图8C,D）。有机氮转运体基因（主要是AAPs和UPSs），特别是TaAAP15-Un和TaUPS2-5D在ZM578中的表达量明显高于XM26（图8E,F）。此外，与XM26相比，ZM578中ATGs（尤其是TaATG8A-2D）和TaNLAs（尤其是TaBAH-2D）的表达量更高（图8G,H），这可能表明ZM578对氮限制有更强的耐受性和更高效的氮循环。

图8.在高氮和低氮条件下生长的耐低氮和敏感小麦植株的芽和根中核心转运体和关键氮（N）代谢相关基因的转录鉴定。(A-H）/、(B)CLC、(C)硝酸还原酶(NIA)、(D)谷氨酰胺合成酶(GLN)、(E)氨基酸渗透酶(AAP)、(F)尿苷渗透酶(UPS)、(G)自噬相关基因(ATG)和(H)氮限制适应(NLA)基因在高氮和低氮条件下生长的小麦植株的芽和根中的差异表达谱。关于RNA-seq实验，小麦植株在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下分别生长20天，直到芽和根分别取样。假发现率（FDR）≤0.05和log2（折合变化）≥1.0是识别DEGs的阈值。H，（高氮）；L，低氮；S，芽；R，根。

6导致小麦基因型耐低氮性差异的候选基因/的分子鉴定

在本研究中，/在异源六倍体小麦基因组中有三个同源物，在A、B和D亚基因组中有一个同源物。研究者对其分子特征进行了全面分析，以更好地理解上述/介导的根木质部NO3高效负载在调控小麦基因型间不同低氮耐受性中的关键作用。基因结构分析表明，/的全长基因组为3554bp，有3个外显子和2个内含子（图9A）。通过全长CDS的分离，研究者发现/和/的序列与“中国春”中的序列完全相同。/编码616个氨基酸，其蛋白质的分子量和pI分别为66.91kDa和6.5。保守结构域分析表明，/属于主要促进剂超家族成员。据预测，/具有很强的亲水性（不包括N端和C端），有九个跨膜结构域（图9B、C）。

图9.异源六倍体小麦中/（最新编号：TraesCS6D03G0593500；原始编号：TraesCS6D02G251500）的分子特征。(A-C)/的基因结构（A）、二级结构（B）和疏水性图（C）。氨基酸的疏水性和亲水性由正值和负值定义。(D-F）/在小麦植株整个生长阶段的组织特异性表达模式。表达谱分析来自小麦eFP浏览器()。热图颜色越深，说明基因表达水平越高。(F)wGRN数据库（）中涉及/的转录调控网络分析。不同颜色的方框表示不同的转录因子。

表达模式分析显示，从幼苗期到分蘖期，/主要在根部表达。从旗叶期到乳粒期，/在旗叶鞘和芽轴的表达水平高于其他器官。在蜡熟期，/的表达达到峰值（图9D）。/与FM4-64一致的强烈定位信号表明，/具有质膜定位转运体的功能（图9E）。调控网络分析显示，ERFs、NACs、MYBs、TALEs、bZIPs和MADSs等转录因子可能参与了/的转录调控（图9F）。为了检测/对其他营养胁迫（包括低钾、低铁、盐胁迫和盐碱胁迫）的转录响应，研究者使用RT-qPCR检测其表达水平。/的表达受到K限制（图10A）、盐度（图10C）和盐碱胁迫（图10D）的强烈诱导，而对低铁没有转录反应（图10B）。

先前的研究报道，拟南芥乙烯反应因子（ERF）ETHYLENEINSENSITIVE3（EIN3）与/启动子中的EIN3结合位点基团结合，抑制其表达（图10E）。转录因子MYB59能正向调节拟南芥/的转录，以应对低K胁迫（图10F）。为了确定TaERF和TaMYB59转录因子是否参与了/的转录调控，研究者研究并比较了耐低氮基因型ZM578和低氮敏感基因型XM26的表达谱。耐低氮栽培品种ZM578（尤其是根）中TaEIN3s/TaEILs的表达水平明显高于低氮敏感栽培品种XM26（图10G），/的表达水平更高。然而，在三个TaMYB59同源物中，只有TaMYB59-3D（TraesCS3D02G540600）在ZM578和XM26中表现出差异表达，且在ZM578中的表达量高于XM26（图10H）。此外，研究者还发现TaMYB59-3D主要在根部表达，与/的表达偏好相似（图10I）。综上所述，研究者认为TaMYB59-3D可能是正向调控/表达的一个关键转录因子，它赋予了耐低氮栽培品种ZM578更高效的根-芽NO3-转化和叶-库相互作用。

图10./对多种营养胁迫的转录响应以及调控/表达的潜在转录因子的鉴定。(A-D）/在低钾（A）、低铁（B）、盐胁迫（C）和盐碱胁迫（D）下的相对表达。Ctrl，对照。在低K处理中，小麦植株在高K/对照（6.0mM）和低氮（0.03mMNO3-）条件下生长20天，直至根部取样。关于低铁处理，小麦植株在高铁/对照（50μMEDTA-Fe）和低铁（2.0μMEDTA-Fe）条件下生长20天，直至根部取样。在盐胁迫处理方面，对在对照组（无盐）和盐胁迫（100mMNaCl）条件下生长20天的小麦植株进行根部取样。关于盐碱胁迫处理，小麦植株在对照组（无盐）和盐碱（75mMNaHCO3）条件下生长20天，直到根部取样。数据以平均值（n=3）±表示，显著差异采用Student'st检验：ns，不显著；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。(E，F）报道的EIN3/EIL介导的/表达的负转录调控和MYB59介导的正转录调控。(G，H）在高氮和低氮条件下生长的低氮耐受基因型ZM578和低氮敏感基因型XM26的芽和根中转录因子基因EIN3/EIL和MYB59的转录谱分析。在RNA-seq和植物激素检测实验中，小麦植株在高氮（6.0mMNO3-）和低氮（0.30mMNO3-）条件下生长了20天，直到芽和根被单独取样。假发现率（FDR）≤0.05和log2（折合变化）≥1.0是识别DEGs的阈值。(I）TaMYB59-D（TraesCS3D02G540600）在小麦植株整个生长阶段的组织特异性表达模式。表达谱分析来自小麦eFP浏览器()。热图颜色越深，说明基因表达水平越高。

讨论

在水稻、玉米和小麦这三种主要谷类作物氮高效利用的分子机制方面，虽然水稻和玉米的研究取得了很大进展，但小麦的研究却鲜有明显成果。本研究综合运用水培、ICP-MS、NMT、HPLC、RNA-seq和生物信息学等方法，对高氮和低氮条件下小麦植株的生长表现、离子和植物激素谱以及全基因组差异表达谱进行了鉴定，并进一步揭示了NUE和耐低氮的调控机制。NPFs、NRT2s、CLCs、SLACs/SLAHs、AAPs和UPSs的转录谱分析表征了参与硝酸盐和有机氮养分高效运输的核心成员。总之，相对于XM26，ZM578更强的耐低氮能力可能与根到芽的硝酸盐高效转运、源叶到库的硝酸盐再动员、液泡硝酸盐释放、有机氮再动员和氮同化有关（图11）。/模块被认为是调节小麦基因型对低氮反应差异的重要途径。这些发现为选育耐低氮和高氮利用效率的小麦种质提供了一些精英候选基因。

图11.显示小麦基因型对低氮耐受性差异的分子机制模型。箭头大小表示小麦植株的氮运输程度。

1同一科内或植物物种之间在表达偏好方面存在巨大差异

在异倍性作物物种中广泛存在的重复基因为新基因的形成提供了新的资源，而新基因的形成又会导致基因丢失、新功能化和亚功能化。基因特异性表达组织、表达丰度和氮响应模式等在不同基因家族成员之间存在显著差异（图3、图4、图7和图8）。根据表达谱分析，研究者很容易区分出在低氮响应和氮利用效率调控中起重要作用的核心成员。例如，（原始编号：TraesCS1D02G214200；最新编号：TraesCS1D03G0536100）的表达丰度最高，明显高于其他NPF家族成员（图3A）。这一结果可作为小麦耐低氮和氮利用效率基因改造时选择候选基因的良好参考。此外，研究者还发现氮转运体的基因表达在单子叶植物和双子叶植物之间存在很大差异。例如，在拟南芥和油菜中，和的转录水平最高。在油菜中，在家族中的表达丰度非常低，而在TaNRT2家族中的表达水平非常高（图3B）。

2/在调节植物生长发育和胁迫响应中的多方面作用

/驱动根到芽的NO3-易位，也参与调节拟南芥对K+剥夺的反应。/的功能性破坏增强了对盐胁迫、干旱和镉毒性的耐受性。/的功能是吲哚-3-丁酸（IBA）的转运体，IBA是主要内源辅助素吲哚-3-乙酸（IAA）的前体。3/主要在生育期的旗叶和籽粒中表达（图9D），此时衰老的小麦根系吸收氮的能力大大降低。结合拟南芥/的功能，/的表达模式表明，/可能参与了根到根的NO3-从源器官到库的转运和再动员（图11）。考虑到/参与调控K饥饿诱导的叶片衰老，研究者对低氮条件下衰老叶片中的K+浓度进行了比较，但耐低氮基因型ZM578与低氮敏感基因型XM26的叶片K+浓度无明显差异（图5K）。因此，研究者认为K+并未参与ZM578和XM26对低氮的不同响应。先前的研究报道，乙烯和JA信号通过乙烯响应因子（ERFs）（包括EIN3/EIL1）介导/的下调，从而进一步调节胁迫耐受性和植物生长。MYB59通过调控拟南芥根中/的表达来应对低K+胁迫并引导根到芽的K+/NO3-转运。在本研究中，基于TaEIN3s/EILs和TaMYB59s在耐低氮栽培品种和低氮敏感栽培品种中的不同表达谱（图10G,H），研究者认为TaMYB59-3D可能参与了/的正转录调控。综上所述，/模块可能在根-根NO3-长距离转运和源叶-库NO3-再动员中发挥了关键作用，从而进一步促进了低氮耐受性和氮利用效率的提高。