胁迫因子与褪黑素处理的火龙果关键调控网络

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摘要

为了应对不断变化的气候条件，植物经常面临多种非生物胁迫，需要强有力的适应机制。本研究侧重于SelenicereusundatusL.对个体胁迫（镉:Cd;盐:S和干旱:D）及其组合应用的反应，重点评估（M）褪黑素的缓解作用。通过转录组分析，本研究确定了显著的基因表达变化和调控网络激活。结果表明，在单一和复合胁迫下，胁迫使火龙果的生长速度降低了30%，茎和枝的发育减少了40%，镉的吸收分别增加了50%和70%。在胁迫条件下，H2O2、POD、CAT、APX和SOD活性增强，脯氨酸含量升高，表明具有很强的抗氧化防御能力。我们确定了141种与胁迫耐受相关的常见DEG，其中大多数与AtCBP、ALA和CBP途径有关。有趣的是，与信号转导和激素（包括脱落酸和生长素）相关的基因的产生也被显著诱导。在M和胁迫处理期间，几个钙依赖性蛋白激酶基因受到调节。功能富集分析表明，大多数DEGs在代谢、MAPK信号传导和光合作用过程中富集。此外，加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定了与抗氧化活性相关的关键转录因子（WRKY、MYB、bZIP、bHLH和NAC），特别是在浅橙色模块内。本研究为火龙果的胁迫反应提供了形态生理和转录组方面的见解，并提出了提高植物抗性的分子育种技术。

关键词：SelenicereusundatusL.（量天尺,红皮白肉火龙果）；单胁迫和组合胁迫；转录组分析；WGCNA;TFs

1.引言

在自然生态系统中，植物受到多种非生物胁迫，包括重金属暴露。这就需要进化复杂的适应机制，以确保生存和繁殖成功。这些适应性策略是通过复杂的胁迫信号通路协调的，这些通路增强了植物的调节能力，优化了它们在不利环境条件下的适应性和恢复力[1]。此外，同时的胁迫会损害营养吸收，破坏转运，削弱免疫防御，并显著限制生长[2]。因此，揭示这些胁迫反应背后的机制，确定与胁迫耐受性相关的关键基因和调控途径，对于推进作物改良策略至关重要。白肉火龙果（SelenicereusundatusL.）最初原产于中美洲，现已成为现代杂交育种计划的重点。作为仙人掌科（仙人掌科）的二倍体物种，SelenicereusundatusL.提供了遗传可及性，使其对基因组研究具有价值。白肉火龙果的基因组已被测序并发表，为正在进行的功能和基因组研究提供了关键资源[3]。白肉火龙果对各种胁迫具有很强的抗性，可用于研究与植物抗逆性相关的基因。RNA测序和微阵列分析为我们了解植物如何应对环境挑战做出了重大贡献。此外，已经进行了广泛的研究，以调查植物对各种胁迫源（如干旱、盐度和重金属污染）的适应性转录组反应，强调了转录组在发现作物植物的胁迫耐受机制方面的关键作用[4-8]。

有趣的是，加权基因共表达网络分析（WGCNA）的应用在识别不同植物物种胁迫信号通路中涉及的必需基因方面发挥了关键作用[9]。转录组研究通过识别共表达和关键的调控基因簇，显著提高了我们对植物对各种胁迫源反应的理解。这些研究主要集中在单一和组合的胁迫源上，如非生物胁迫和重金属，揭示了复杂的分子机制和适应策略[10]。然而，关于火龙果对单一、双重和多因素胁迫的反应及其从这些胁迫中恢复的基因共表达网络，还有很多需要了解的地方。然而，考虑到植物对各种胁迫源的复杂反应，现在很明显，涉及许多生化和生理过程的整体策略对植物的生存至关重要[11]。因此，将WGCNA与综合方法相结合，以了解多方面的胁迫反应，可以提供更深入的见解，并推进我们在这一领域的知识。

与多种胁迫综合影响相关的几个蛋白质编码基因对植物的生长和存活构成了重大威胁，因此研究火龙果在不同胁迫条件下和恢复阶段的共表达模式至关重要。据报道，糖代谢调节、分子伴侣、渗透物质合酶、转运蛋白和抗氧化保护剂在赋予抗逆性方面起着直接作用[12]。此外，许多转录因子（TF），包括WRKY、NAC、MYB、bHLH和HD-ZIP，积极参与信号转导和基因表达调控，并在综合组学分析中得到了广泛的研究[13]。研究表明，活性氧（ROS）、活性氮（RNS）与植物超积累、胁迫防御机制和镉（Cd）反应相关的胁迫反应途径之间存在联系[14]。此外，植物使用褪黑素（M）作为非生物胁迫的调节因子，它与生长素共享一个前体分子，也起着生长素样调节因子的作用。它通过各种途径对提高植物对非生物胁迫和重金属毒性的抵抗力产生了重大影响[15]。此外，它还影响生长素途径，调节植物激素，并调节TFs的表达[16]。研究表明，M的应用可以减少氧化损伤，增强解毒过程，增加胁迫反应基因的表达，最终提高植物在胁迫条件下的存活率[17]。抗氧化剂通过维持细胞氧化还原稳态和防止氧化损伤，在减轻生物和非生物条件下的胁迫方面发挥着至关重要的作用。为了应对生物胁迫，植物会激活抗氧化防御系统，以抵消ROS产生增加造成的氧化损伤。同样，在非生物胁迫下，抗氧化剂有助于维持ROS稳态，以保护植物免受氧化胁迫。ROS清除和ROS产生途径之间的平衡对于有效防御这两种胁迫至关重要[18,19]。

本研究旨在从转录组水平阐明火龙果对非生物胁迫的复杂分子反应。为了实现这一目标，提出了一种综合策略，包括将M应用于植物，并随后分析各种胁迫条件下的转录模式。此外，还研究了火龙果在单因素和多因素胁迫下的生理和表型反应。最后，成功鉴定了显著的基因表达变化、激素介导的信号通路和胁迫反应基因簇。这些发现有望阐明控制SelenicereusundatusL.胁迫反应的复杂调控网络。这种全面的方法旨在加深对胁迫适应机制的理解，促进培育具有更好抗逆性的健壮品种。

2.结果

2.1.单一和组合胁迫下的表型特征和植物材料

火龙果植物对各种非生物胁迫表现出不同的形态和生理反应，包括盐（S）、干旱（D）和镉暴露。在这些胁迫条件下，火龙果植物表现出独特的适应机制。当暴露于S时，幼苗的根长（RL）减少了20%，茎长（SL）减少了15%。接触镉会产生更明显的影响，SL和RL分别降低了20%和25%。干旱胁迫（D）导致枝长（CL）和枝径（CD）均减少30%。Cd和D的组合胁迫特别严重，导致RL降低40%，SL降低35%。涉及Cd、S和D的联合胁迫处理进一步加剧了所有测量参数的生长下降（图1）。然而，在这些单一和组合胁迫条件下，M处理显著提高了植物的抗逆性。值得注意的是，在CdSD的复合胁迫条件下，施用M导致植物的SL增加到近60%。这些发现强调了M在胁迫条件下改善植物整体生长方面的显著影响，突显了其作为植物非生物胁迫强有力缓解剂的地位。

图1.火龙果在单一、双重和多因素胁迫组合下的形态生理反应：（A）单一和复合胁迫对火龙果植物生长的影响。（B）表型测量，包括根长（RL）、根重（RW）、茎长（SL）、茎重（SW）、枝长（CL）和枝径（CD）。在5%（p≤0.05）的概率水平上使用单因素方差分析对治疗进行比较，并使用邓肯检验对平均值进行比较。不同字母在品种间显示出统计学上的显著差异；相似的字母表示统计上不显著的值，而条形图表示标准误差。（C）不同处理的镉定量，误差条表示标准偏差。（D）相关矩阵显示RL（cm）、RW（g）、SL（cm），SW（g），CL（cm）和CD（mm）之间的显著关系。显著相关性由0.05至0.001的p值表示。缩写：控制（Ck）；褪黑素（M）；盐度（S）；干旱（D）；镉（Cd）；镉+盐度（CdS）；镉+干旱（CdD）；镉+盐度+干旱（CdSD）；镉+盐度+褪黑素（CdSM）；镉+干旱+褪黑素（CdDM）；镉+干旱+盐度+褪黑素（CdDSM）。

2.2.对单一和复合胁迫的生化反应

生化分析显示，对不同胁迫处理的反应存在显著差异，如图2所示。值得注意的是，与Ck水平为20±1μmol/g相比，M处理中的过氧化氢（H₂O₂）水平显著升高，达到55±2μmol/g（）。在Cd、S和D等单一胁迫条件下，H₂O₂浓度分别增加到30±1.5μmol/g、40±2μmol/g和45±2.5μmol/g，均显著高于对照组（）。结合胁迫处理，特别是CdS和CdSD，进一步将H₂O₂水平提高到50±2μmol/g（）（图2A）。酶活性也存在显著差异。与对照组相比，S和D处理组的抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性升高，分别记录为2.0±0.1和2.1±0.1nmol/min/mg蛋白质，记录为0.7±0.01nmol/min/mmg蛋白质（）（图2B）。有趣的是，在CdSD等组合胁迫情况下，APX活性达到1.3±0.01nmol/min/mg蛋白质（）。此外，过氧化物酶（POD）水平也呈现出类似的趋势，在S和D胁迫下观察到的最高活性分别为125±5U/g和130±6U/g（）。复合胁迫，如CdS和CdSD，也显示出POD活性增加，分别为110±4U/g和105±5U/g（）（图2C）。相比之下，对照植物的过氧化氢酶（CAT）活性最高，为2.5±0.1μmol/min/g。涉及S和D的单一胁迫条件显著降低了CAT活性，分别为0.5±0.01和1.0±0.01μmol/ming/g（）。复合胁迫保持或略微增强CAT活性，CdS和CdSD记录值分别为1.3±0.01和1.2±0.01μmol/min/g（）（图2D）。与对照组相比，S和D处理组的超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高，分别为5.5±0.2和6.0±0.2U/mg蛋白质（），为3.5±0.1U/mg蛋白质。复合胁迫条件下CdSD进一步将SOD活性提高到6.5±0.3U/mg蛋白质（）（图2E）。脯氨酸含量是一种关键的渗透保护剂，在S处理下显著增加到110±5μg/g（），而对照值为40±2μg/g。CdS、CdSD和CdSM等复合胁迫条件分别将脯氨酸水平提高到95±4μg/g、100±5μg/g和90±4μg/g（）（图2F）。这些结果共同强调了火龙果植物在非生物胁迫下所经历的复杂生化变化。氧化胁迫标志物和抗氧化酶活性的显著变化表明了植物防御机制的复杂性。此外，脯氨酸水平的增加突显了渗透保护剂在胁迫耐受中的关键作用。

图2.火龙果苗期对单、双和多因素胁迫的生理反应。（A）过氧化氢浓度（μmol/g）；（B）抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性（mmol/min/g）；（C）过氧化物酶（POD）活性（U/g）；（D）过氧化氢酶（CAT）活性（μmol/min/g）；（E）超氧化物歧化酶（SOD）活性（U/gWST-8）；（F）脯氨酸（PRO）含量（μg/g）。每个条代表平均值±标准差（n=3），条上的不同字母表示p≤0.01时处理之间的显著差异。缩写：控制（Ck）；褪黑素（M）；盐度（S）；干旱（D）；镉（Cd）；镉+盐度（CdS）；镉+干旱（CdD）；镉+盐度+干旱（CdSD）；镉+盐度+褪黑素（CdSM）；镉+干旱+褪黑素（CdDM）；镉+干旱+盐度+褪黑素（CdDSM）。

2.3.火龙果的转录组结果

对在胁迫处理、对照条件和M处理下生长的植物收集的所有样本进行RNA-seq分析。在删除适配器序列和低质量读取后，获得了干净的读取，读取计数范围为19086388到30788568。所有15个文库的Q20和Q30值分别超过98%和95%，证明了高质量的测序数据。此外，各处理组的GC含量范围约为45%至46%，突显了研究样本中基因组组成的一致性（补充表S1）。

2.4.火龙果幼苗对单因子、双因子和多因子胁迫的基因表达分析

为了探索火龙果对单一、双重和多因素胁迫的反应，我们研究了单一胁迫（M、S、D和Cd）、双因素胁迫（CdSvsCk、CdDvsCk）和多因素胁迫（CdSMvsCdS、CdDMvsCdD、CdDSMvsCdSD）中常见和独特的基因集，如图3所示。火龙果植物对胁迫组合有反应，在单因素胁迫（M、S、D和Cd）下有46组常见的DEG，在双因素胁迫下有95组DEG。在单因素分析中，共观察到4610个DEGs，与Ck治疗的结果相比，S治疗有2080个上调基因和2530个下调基因。同样，D治疗显示635个DEGs（368个上调，267个下调），而M治疗导致1055个DEGs的鉴定（468个上调，587个下调）。此外，镉处理导致3995个DEGs（1840个上调，2155个下调）（图3A，B）。转到双因素分析，CdS处理显示868个DEGs（314个上调，554个下调），CdD处理显示463个DEGs，235个上调，228个下调（图3C，D）。在多因素分析中，CdSD与CdDSM显示1153个DEG（202个上调，951个下调），CdSM与CdS显示61个DEG，47个上调，14个下调，与Ck治疗相比，CdDM与CdD导致831个DEG。（659个上调，177个下调）（图3E，F）。

总体而言，在所有单因素、双因素和多因素分析中，共有141个常见基因表现出差异表达。这些对非生物胁迫和重金属耐受性有反应的基因被认为是关键的候选者，值得在后续研究中进一步深入研究和探索。

图3.鉴定对单因素、双因素和多因素胁迫处理（A、B）的总差异表达基因和常见差异表达基因（DEGs）。单一胁迫处理中常见的上调和下调DEGs：干旱与对照（D-vs-Ck）、褪黑素与对照（M-vsCk）、盐度与对照（S-vs-Ck、镉与对照（CdvsCk）；（C，D）双重胁迫处理的DEGs：镉+盐度与对照组（CdS与Ck），镉+干旱与对照组的DEGs（CdD与Ck）；（E，F）多因素处理的DEGs：镉+盐度+干旱与镉+干旱+盐度+褪黑素（CdSD与CdDSM），镉+干旱与Cd+干旱+褪黑素（CdD与CdDM），镉-盐度与镉+盐度-褪黑素（CdS与CdSM）。

2.5.DEGs基因GO和KEGG通路富集分析

火龙果表现出复杂的抗性机制，包括单一、双重和多因素胁迫。应用M后，上调的差异表达基因（DEGs）在各种生物过程（BP）和分子功能（MF）中富集，如氧化还原酶活性、氨基糖分解代谢、几丁质代谢/分解代谢过程、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和几丁质酶活性。然而，没有细胞成分（CC）类别显示出显著的富集。具体而言，上调DEGs的BP术语显著丰富，包括参与防御反应、信号转导和次生代谢物生物合成过程的DEGs。对于MF，水解酶活性、蛋白质结合和抗氧化活性等方面显著增强。相反，DEGs表达的减少与BP分类显著相关，包括初级代谢过程、细胞成分组织和运输。下调DEGs的MF特征包括核苷酸结合、酶调节活性和离子结合。此外，下调的DEGs在细胞成分（CC）类别中的细胞内和膜结合细胞器方面表现出富集。

施用S后，上调和下调的DEGs都富含BP和MF类别，包括与光系统I、质体小叶、质体类囊体膜、光合作用、光系统I中的光产生和叶绿素结合有关的DEGs。在干旱条件下，上调的DEGs在与有机酸、含氧酸和羧酸代谢过程相关的BP术语中富集。CC项包括细胞壁、细胞外区和外膜结构，而MF项富含氧化还原酶和催化活性。

镉的施用导致DEGs在与DNA整合、系统获得性抗性和对生物刺激的反应相关的BP术语中富集。CC类在细胞壁、细胞外区域和外膜结构中富集，而MF类在丝氨酸水解酶和丝氨酸型肽酶活性中富集。上调的DEGs（由CdS诱导的变化）在与生长素刺激诱导的细胞反应、韧皮部发育和细胞壁组织或生物发生相关的BP类别中显著富集。MF类下调的DEGs在氧化还原酶活性方面得到了富集；CC类在细胞外空间、细胞壁和外膜结构中富集；BP类在次生代谢过程、防御机制和生物刺激反应方面得到了增强。

CdD应用富集了与氨基糖、含葡糖胺化合物和细胞壁大分子的分解代谢过程相关的BP类别中上调的DEGs。CC类在外包囊结构中富集，MF项与多糖上的裂解酶活性有关，特别是几丁质酶、果胶酸裂解酶和碳氧裂解酶的活性。下调的DEGs包括与光合作用、光系统I中的光产生和叶绿素结合相关的BP术语。CC类别包括质体膜、光系统II、类囊体膜和光系统。

上调的DEGs是由CdSD和M的联合应用引起的变化，富含与细胞壁组织或生物发生以及RNA生物合成调节相关的BP类别。MF项与转录调节因子和DNA结合TF活性有关，与CC类别有关的富集项不显著。下调的DEGs与氮化合物分解代谢、有机物分解代谢过程和细胞分解代谢过程有关。MF项在氧化还原酶、脂肪酶和催化活性方面得到了丰富，而CC项在膜、固有膜组分和整体膜组分中得到了丰富。

CdSM应用诱导的DEGs富含与光合作用、光系统I光捕获和光反应相关的BP类别。MF项在酰基转移酶活性方面富集，CC项在类囊体膜方面富集。BP类别在苯丙烷代谢途径和次级代谢途径、全身获得性抵抗和胁迫反应方面也得到了丰富。MF项包括咖啡酰辅酶AO-甲基转移酶活性，CC项在细胞外空间、细胞壁和外壳结构中富集。CdDM相关DEGs显示MF项涉及酰基转移酶、长链醇O-脂肪酰基转酶和酰基甘油O-酰基转转移酶活性。BP术语在甘油三酯代谢和生物合成过程方面得到了丰富。BP类下调的DEGs在苯丙烷代谢方面富集，而MF项包括氧化还原酶、催化和几丁质酶活性。CC术语在细胞外空间、质外体和外膜结构中富集（补充文件S2，图S2）。

KEGG途径富集分析表明，代谢途径在所有单因素、双因素和多因素胁迫处理中都主要富集。在十大富集途径中，丙酮酸代谢（ko00620）、MAPK信号传导（ko04016）、糖酵解/糖异生（ko00010）以及氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520）在M治疗后上调。盐度（S）胁迫诱导的途径与光合作用（ko00195）、光合生物中的碳固定（ko00710）、乙醛酸和二羧酸代谢（ko00630）、丙酮酸代谢（）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（ko00260）和糖酵解（ko00010）有关。干旱胁迫诱导的途径包括MAPK信号传导（ko04016）、植物-病原体相互作用（ko04626）、色氨酸代谢（ko00380）、苯丙烷生物合成（ko00940）和组氨酸代谢（ko00440）。镉（Cd）胁迫导致代谢途径、光合作用（ko00195）、碳固定（ko00710）、丙酮酸代谢（ko00620）、色氨酸代谢（ko00380）以及果糖和甘露糖代谢（ko00051）富集。CdS胁迫诱导的途径与代谢、光合触角蛋白（ko00196）、苯丙烷类生物合成（ko00940）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）以及角质、木栓质和蜡的生物合成（ko00073）有关。CdD胁迫涉及代谢和环境信息处理途径，包括与氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520）、戊糖和葡萄糖醛酸转化（ko00040）、苯丙烷类生物合成（ko00940）、MAPK信号传导（ko04016）和植物激素信号传导（ko04075）相关的途径。

多因素胁迫与褪黑素的应用相结合，诱导了植物激素信号传导（ko04075）、光合触角蛋白（ko00196）、α-亚麻酸代谢（ko00592）和聚糖降解（ko00511）等途径。CdSM处理诱导的途径涉及代谢、光合天线蛋白（ko00196）、甘油磷脂代谢（ko00564）、卟啉和叶绿素代谢（ko00860）以及其他次生代谢物的生物合成（ko00945）。最后，CdDM处理导致与代谢过程、黄酮类生物合成（ko00941）、苯丙烷类生物合成（ko00940）、MAPK信号传导（ko04016）、其他次生代谢物的生物合成（ko0945）以及氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520）相关的途径丰富（补充文件S2，图S2）。

利用差异表达基因（DEGs）对GO和KEGG通路富集分析的研究揭示了火龙果植物胁迫适应反应的关键见解。与氧化胁迫反应和抗氧化活性相关的基因的增强表明了对抗胁迫诱导损伤的强大防御机制。激活脱落酸（ABA）和乙烯等关键激素信号通路突显了它们在管理胁迫中的重要作用。此外，次生代谢物产量的增加和碳水化合物代谢途径的变化表明，这是一种战略性的代谢重组，可以提高胁迫反应能力。

2.6.与植物激素和信号转导相关的DEGs的鉴定

在这项研究中，GO和KEGG富集分析表明，单一和组合胁迫影响了植物信号传导。据估计，火龙果中有4100多个基因编码蛋白激酶，其中大多数是受体样蛋白激酶（RLK），主要是LRR受体激酶。其中，2522个基因在单次和联合胁迫治疗中表现出上调，表明对各种胁迫反应的一致性。在CdDSvs-M处理下，KIN7G（HU06G00111）上调5.07倍。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在单因素、双因素和多因素胁迫条件下包含118多个基因。值得注意的是，MAPK信号通路（ko04016）在所有胁迫处理和M应用中都得到了一致的诱导。在M-vs-Ck比较中，DEGsSP2和SE2（HU06G01804和HU09G00018）显示出4.74倍的显著上调。盐胁迫诱导了三种AUX相关DEGs（HU01G00719、HU01G02696和HU03G01065）的表达。此外，D-vs-Ck特异性诱导ERFs（HU04G00142和HU07G00322）的表达增加4.74倍。几种bHLH转录因子（TF）被触发高达4.04倍，特别是在镉胁迫下（补充表S3）。

在CdD与Ck治疗下，基因SAUR19（HU03G00209）和CKX5（HU07G00730）的表达显著增加了4.16倍。同样，基因AUX22D（HU03G00941）和CCL4（HU03G1065）在CdS与Ck治疗后显示出9.55倍的显著上调。在CdDM与CdD治疗中，CRK10基因的表达显著升高。相比之下，在CdSM与CdS治疗期间，基因FTIP7（HU07G00235）和CDR1（HU05G01809）表现出令人印象深刻的22.46倍上调。最后，在CdSD与CdDSM治疗下，基因sbt3（HU03G00941）和CYP78A5（HU04G01473）的表达增加了8.21倍（补充表S4）。

已鉴定出与钙离子和编码蛋白质（如钙结合蛋白、钙调素样蛋白和钙通道蛋白）相关的DEG。值得注意的是，编码钙通道蛋白的基因HU01G01871、HU09G01890、HU06G01765、HU03G00725、HU09G1890和HU10G01023在非生物胁迫下表现出持续的高表达。在各种单一和联合治疗中，它们的上调幅度为3.77至7.89倍（补充文件S5）。

共有343个DEGs参与ROS的清除和产生，包括编码POD、APX和其他抗氧化酶的基因。值得注意的是，编码POD的HU03G02481（PRXQ）在S-vs-Ck中的表达上调了5.10倍。同样，在各种胁迫条件下，编码APX的基因与对照组相比上调了3.27至3.63倍。此外，编码ent-kaurene氧化酶的HU11G00956（KO）在CdS和CdSM中的表达上调了4.47倍。过氧化物酶基因HU08G01569和HU03G01694（PER47和HRPN）在CdSD与CdDSM中上调了4.27倍，在CdD与CdDM中表达最高（补充文件S6）。

在单一和复合胁迫下，参与激素生物合成或信号传导的基因表达发生了显著变化。几个基因与ABA、生长素、BR、细胞分裂素、ET、JA和SA有关。在这些DEGs中，大多数基因参与生长素反应。M应用诱导了编码基因的表达，SAUR71和LAX2（HU07G00614，HU03G00380）上调了3.668577倍。此外，还诱导了与ABA、生长素、BR、细胞分裂素、ET、JA和SA反应相关的几个基因的表达。其中，大多数DEGs参与乙烯和生长素反应。有趣的是，S胁迫诱导的基因编码DREB3（HU09G01420）和SAUR19（HU03G00209）是7.20倍，而另一个编码ABP19A（HU03GO2416）的基因显著下调，下降了15.74倍。

ABA、生长素、BR、细胞分裂素、ET、JA和SA基因在不同条件下表现出不同的反应。例如，在D-vs-Ck比较中，编码SAUR71的HU07G00614的表达上调了1.51倍。相反，另一个编码SAUR32的基因HU11G01616在相同的比较中显示出-1.54倍的显著下调。此外，这些激素相关基因，特别是ABA和BR反应基因，在D胁迫下主要上调。

在Cd与Ck和CdS与Ck的比较中，分别编码IAA4和BSK3的HU03G01066和HU11G01802的表达显著上调了7.24/6.34倍。然而，分别编码ABP19B和SERK2的HU03G02418和HU02G01222的表达显著下调了-11.98/-7.65倍。

在镉（CdD）胁迫下，编码SAUR19的基因（HU03G00209）上调了4.16倍，而编码SAUR32的另一个基因（HU11G01616）显著下调了1.57倍。CdS胁迫诱导编码ERF012（HU07G00322）的基因下调4.73倍，而编码ERF1B（HU06G02316）的基因则下调-8.08倍。

有趣的是，镉CdDM处理导致大多数基因参与ABA反应。九顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是ABA生物合成中的关键酶。例如，一个编码ABP19A的基因（HU03G02416）在CdDM的反应中上调了11.87倍。

CdDSM处理诱导了ABA、生长素、BR、细胞分裂素、ET、JA和SA等基因的上调。例如，编码SAUR19的HU03G00209基因的表达上调了5.68倍。然而，编码ERF1B的另一个基因（HU05G00493）的表达显著下调了9.05倍。此外，在Cd和D胁迫下，生长素生物合成相关基因（HU03G01066、HU03G01068、HU03G_02410）下调，而在S胁迫下上调（补充文件S7）。

共鉴定出24个参与生长素信号通路的基因发生了变化。其中，编码生长素反应因子的三个基因（ARF21、ARF9和ARF18）与单、双和多因素诱导的过程有关。值得注意的是，当暴露于干旱（D）和盐度（S）时，ARF19（HU03G02449）的表达进一步降低。在镉（Cd）胁迫下，ARF21（HU02G03105）继续以较高水平表达。编码AUX/IAA蛋白的两个基因在CdS、CdD和CdDM条件下下调，但在单独用S、D和Cd处理下上调。此外，还鉴定了一些参与生长素反应和信号传导的基因，如生长素转运蛋白样蛋白2（LAX2）和生长素结合蛋白ABP19A样（ABP19A）。响应茉莉酸甲酯（M），ABP19A基因（HU11G00352）上调7.38倍。编码SAUR的基因（SAUR19；HU03G00209）在S胁迫下表现出7.20倍的上调（补充文件S9）。

几个乙烯反应转录因子（ERF）基因在单因素、双因素和多因素胁迫条件下表现出表达趋势。值得注意的是，ERF017（HU03G02451）在镉胁迫（HU05G00493）下显示出6.40倍的上调，随后在D-vs-CK条件下显示出11.70倍的下调。此外，ERF025（HU04G00142）在相同的胁迫条件下表现出4.07倍的上调。在此期间发现了乙烯过量生产蛋白1（ETO1）、乙烯受体（ERS1）和乙烯不敏感的3样蛋白（EIL3）（补充文件S7）。并非每种治疗都涉及与茉莉酸（JA）的产生或交流相关的大多数基因。此外，绝大多数基因与水杨酸、油菜素内酯（BRs）和细胞分裂素途径有关。一个编码细胞分裂素脱氢酶5的基因（HU11G01282）在镉胁迫下下调了-2.25倍。研究结果强调了火龙果对非生物胁迫的复杂和特异的遗传反应，展示了一个强大而适应性强的调控网络。MAPK信号通路和各种受体样蛋白激酶在不同胁迫条件下的显著增加突显了它们在检测和应对胁迫方面的关键作用。与ROS清除和激素信号传导相关的基因的显著激活强调了它们在缓解胁迫效应和维持细胞平衡方面的重要性。此外，在单一、双重和多重胁迫下观察到的独特基因表达模式为火龙果胁迫适应背后的复杂机制提供了有价值的见解。

2.7.代谢和生物合成相关基因的表达

与蔗糖合酶和淀粉合酶相关的几个基因显示出增强的表达水平。编码SUS6、SE2和SS的基因（HU03G00958、HU03G00058、HU11G00421、HU09G00019）在单一处理下分别上调了2.93、1.19和11.03倍。编码淀粉合酶的基因很少下调，而大多数似乎上调。此外，单一和联合治疗增加了参与果糖、甘露糖和淀粉代谢的酶的基因表达。其中包括编码果糖-1,6-二磷酸酶、果糖二磷酸醛缩酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶α、焦磷酸果糖6-磷酸1-磷酸转移酶亚基β样和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶的基因（补充文件S8）。这些发现强调了火龙果在胁迫条件下发生的适应性代谢重编程，特别是在碳水化合物代谢中，这可能有助于能量生产和胁迫耐受。蔗糖和淀粉代谢相关基因的上调表明能量储存和利用能力增强，这对应对非生物胁迫至关重要。

2.8.单一和组合胁迫下光合作用相关基因

单一和组合胁迫诱导了许多与光合作用相关的DEGs。共鉴定出35个与光合作用相关的DEGs，其中3个（PSB27-1、PSAN、PSAE-1）编码光系统I（PSI）的成分，并在S和Cd胁迫处理下表现出轻微的上调。此外，CdD、CdSD和CdDSM处理也诱导了光合作用相关基因。共鉴定出35个编码PSI和PSII的基因，其中11个基因上调（PSEA-1、PSAF、PSAK、PSAL、PSAN、PSB27-1、psbB、HCF136、PSBR、psbW），8个基因下调。此外，许多编码氧化还原链的基因在不同胁迫条件下表现出显著的上调或下调。此外，编码叶绿体成分的411个基因的表达显著增加（补充文件S10）。这些观察突出了火龙果植物在非生物胁迫下光合作用机制的复杂调节，反映了维持光合作用效率和能量生产的努力。光合作用和叶绿体相关基因的上调表明了一种适应性反应，旨在优化胁迫条件下的光捕获和电子传递。

2.9.对单因子、双因子和多因子胁迫有反应的转录因子

重要的调控转录因子（TF）可以上调或下调与靶基因启动子中顺式作用调控元件特异性结合的基因。在这项研究中，发现了大量的转录因子，包括WRKY（64）、NAC（43）、MYB（80）、bZIP（16）和bHLH（54）。WRKYTFs在各种处理后表现出显著的表达改变。在单因素胁迫处理下，观察到某些基因的表达水平较高。编码WRKY70、WRKY41、WRKY40、WRKY44和WRKY14的基因（HU02G02628、HU11G01694、HU03G00514、HU04G00301、HU06G02430和HU05G01710）达到最高表达水平，分别上调3.80、2.25、3.81、2.77、8.40和6.63倍。然而，编码WRKY的基因在单因素、双因素和多因素胁迫下下调，倍数变化范围为-1.32至-9.66。35个WRKY家族基因在盐度（S）胁迫下表现出较低的表达水平（补充文件S11）。

编码NAC的基因中有一半以上在不同程度上上调。编码NAC071、NAC092、NAC006、NAC090、NAC100和NAC104的基因（HU04G00486、HU01G02396、HU01/G00420、HU07G02058、HU05G01179、HU03G00770）在单一和组合胁迫下达到最高表达水平，分别上调约2.31、2.46、1.39、2.98、4.64和4.3倍。有趣的是，NAC100（HU05G01179）在CdDM处理条件下上调了4.64倍，但在Cd处理下略有下降，然后在S胁迫下从4.84倍降至-5.38倍，在复合胁迫下增加了2.71倍。NAC6（HU01G00420）表现出类似的表达趋势，略有上调。相比之下，编码NAC047（Novel8333）的基因在S和CdDSM的反应中下调，但此后其表达继续增加（补充文件S11）。

在各种多因素处理下，超过75%的MYB基因在表达水平上表现出不同程度的上调。其中，在镉处理过程中出现了大量上调的基因。例如，MYB117（HU10G00373）和MYB306（HU06G01167）的上调程度最高，分别为5.69倍和4.64倍。此外，在盐度（S）胁迫下，一些基因显示出显著的上调。MYB59（HU02G01484）在单次治疗后，在所有上调的基因中，上调水平最高，增加了3.69倍。在多因素治疗期间，一些基因倾向于先增加后减少。例如，编码MYB61（HU08G01429）的基因在S胁迫下略有增加，然后其表达降低了1.80倍。经过双重和多因素分析，只有一小部分基因表达上调，而与对照组相比，大多数基因表达保持相对不变（补充文件S11）。

在单因素、双因素和多因素胁迫处理下，几种bHLH-TF上调。与其他处理相比，bHLH家族的大多数基因在s和Cd胁迫下上调。另一方面，在M-vs-Ck和CdSvs-Ck比较中，大量基因被下调。其中观察到小幅增加，监管从1.02增加到4。在Cd与Ck的比较中，有66倍。尽管如此，仍有21个基因被下调。一个bHLH81编码基因（HU02G02661）下调了-4.83倍（补充文件S11）。我们对火龙果中关键转录因子（TF）家族在不同非生物胁迫下的表达动态进行了彻底的研究。该分析识别了转录因子及其不同的表达模式，为进一步的功能研究和潜在的基因改造提供了关键靶点，以提高火龙果的抗逆性。观察到的复杂调控机制突显了植物对胁迫反应的复杂性，表明了未来研究可以深入研究这些转录因子在适应胁迫方面的具体功能和相互作用的潜在途径。

2.10.褪黑素诱导ROS清除和昼夜节律时钟基因

我们的研究揭示了M如何在单一和复合胁迫下影响基因表达。我们的研究结果表明，M调节与胁迫反应、抗氧化防御和昼夜节律相关的重要基因的表达。与抗氧化酶相关的几个基因，如谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），包括HU07G01008；HU02G03407；HU04G01183；HU05G00832；HU08G01598；HU01G01343；HU06G02305；SPA1，HU07G00071；LHY，HU11G01590；NIN3；HU07G02013-的表达上调。这些参与调节细胞的抗氧化能力。此外，与免疫功能相关的基因的表达，如编码参与炎症和胁迫反应调节的细胞因子和趋化因子的基因，受M调节。此外，M影响蓝光受体活性基因如CRY1和CRY2的表达。这些参与了昼夜节律调节的调节，这对几个生理过程有影响。总的来说，这些结果表明了M影响基因表达以支持和维持细胞稳态的多种方式。

2.11.WGCNA模块的共表达网络构建与识别

基因共表达网络中的基因聚类和模块切割将具有相似表达模式的基因聚集在同一分支上。通过WGCNA评估了从转录组数据中获得的29905个基因的表达模式，并过滤了一半以上样本中未表达的基因。根据表达模式的相似性，总共发现了15个模块（图4A）。聚类分析的热图可视化用于评估模块中存在的基因（图4B）。此外，建立了模块-性状相关关系，以确定与单因素、双因素和多因素胁迫的显著相关性（图4C）。存在六个模块，其属性与九种治疗方法相关；其中可见浅橙色、紫色、黑色、粉色、蓝色和黄色。对六个选定模块的表达模式进行了分析，特征基因的表达模式作为模块整体基因表达谱的表示（图4）。

图4.加权基因共表达网络分析（WGCNA）。（A）模块-特质关系：每一列代表不同的加工条件。每一行对应模块的特征基因。在每个单元格中，皮尔逊相关系数和括号中的p值表示两者之间的相关性。细胞颜色范围从红色（表示高度正相关）到绿色（表示高度负相关）。每个模块中包含的基因数量显示在左侧的括号中。（B）模块级聚类图。（C）网络热图图。

GO和KEGG分析揭示了六个带注释的模块：浅橙色、紫色、黑色、粉色、蓝色和黄色。浅橙色模块显示出代谢和分解代谢过程的显著富集，特别是在细胞外区域、锚定膜成分和次生代谢过程中。KEGG分析表明生物合成途径主要富集。在CdS胁迫下，紫色模块在氨基糖和核苷酸糖代谢方面表现出富集，KEGG途径突出了戊糖磷酸途径。黑色模块显示了转录调节因子活性的富集，包括DNA结合转录因子和泛素蛋白转移酶活性，以及D的恢复过程。KEGG分析强调信号转导是富集的主要形式（图5；补充文件S12和S13）。

图5.代表性模块中共表达基因的表达模式。（A）浅橙色模块；（B）黑色模块；（C）黄色模块；（D）粉红色模块；（E）蓝色模块；（F）紫色模块。缩写：控制（Ck）；褪黑素（M）；盐度（S）；干旱（D）；镉（Cd）；镉+盐度（CdS）；镉+干旱（CdD）；镉+盐度+干旱（CdSD）；镉+盐度+褪黑素（CdSM）；镉+干旱+褪黑素（CdDM）；镉+干旱+盐度+褪黑素（CdDSM）。

在GO分析中，CdSD粉红色模块在核苷酸结合和胁迫反应方面显著富集，谷胱甘肽途径在KEGG分析中也得到了类似的强调。同时，CdSD中的蓝色模块富含分解代谢过程，在GO和KEGG分析中也显示出重要意义，突出了其他次生代谢物的生物合成。相比之下，在代谢代谢分析中，黄色模块被突出显示。浅橙色和蓝色模块是GO分析中胁迫反应项的主要目标，表明这些模块在单一和组合胁迫反应中起着重要作用（图6；补充文件S12和S13）。

图6.基于基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）的浅橙色模块中差异表达基因（DEGs）的分析。（A）前20名GO富集；（B）KEGG富集度排名前20位。（注：q值范围为0至0.05，值越近表示显著性越高。提供了通路中富集的基因数量）。

2.12.枢纽TFs的识别与网络建设

在每个模块中，检查了几个TF，其中大多数与WRKY、NAC、MYB、bHLH和bZIP有关，尽管它们的分布在模块之间有所不同。在浅橙色模块中，许多WRKY、MYB、NAC和bHLHTF共表达（图7A）。根据中心基因相关网络及其高连接性，选择了17个TFs：WRKY（HU02G02539、HU06G00411、HU01G00584和HU10G01980）；NAC（HU07G00854、HU02G00350、HU04G01575和HU10G00380）；bZIP（HU09G01935、HU09G01579和HU10G00504）、MYB（HU03G00868、HU06G01932和HU06G00027）；以及bHLH（HU02G02661、HU04G01932和HU01G00293）（图7B）。除干旱（D）胁迫外，实验表明，这些基因在S、M、CdSD和CdDSM中的表达显著上调（图7B）。发现包括WRKY、NAC、MYB、bHLH和bZIP在内的15个TF是蓝色模块中的中心基因（图7C）。在HU02G01423、HU09G01037、HU06G02188、HU08G01835、HU04G02201、HU07G00854、HU01G00820和HU10G00331之间发现了更高的连接性（图7C）。在S、M、CdSD和CdDSM中，所有15种TF的表达都较高（图7C）。

图7.浅橙色和蓝色模块中枢转录因子（TF）的鉴定和选择。（A）浅橙色模块中TF的网络分析；（B）浅橙色模块中前17个枢纽TFs和相关基因的网络；（C）蓝色模块中集线器TF的网络分析。缩写：控制（Ck）；褪黑素（M）；盐度（S）；干旱（DA）；镉（Cd）；镉+盐度（CdS）；镉+干旱（CdD）；镉+盐度+干旱（CdSD）；镉+盐度+褪黑素（CdSM）；镉+干旱+褪黑素（CdDM）；镉+干旱+盐度+褪黑素（CdDSM）。WRKYTF（WRKY）；成髓细胞增多症TF（MYB）；基本螺旋-环螺旋TF（bHLH）；碱性亮氨酸拉链（bZIP）；NAM、ATAF和CUC（NAC）。

2.13.通过qRT-PCR验证DEGs

研究结果表明，几个基因的RNA-seq和qRT-PCR数据之间存在很强的相关性，表明转录组数据得到了可靠的验证。具体而言，分析了五个基因，即HU02062539_WRKY、HU01600584_WRKY，HU07060854_NAC、HU03060868_MYB和HU01060293_bHLH（图8）。对于每个基因，结果显示在散点图中，比较了从RNA-seq和qRT-PCR数据中获得的log2倍值。图上显示的相关系数（r）和回归方程表明两种方法之间具有高度的一致性。对于HU02062539_WRKY，该图显示出显著的相关性（r=0.9176），表明RNA-seq数据检测到的基因表达变化是可靠的，与qRT-PCR验证一致。

图8.不同处理（如Ck、M、S、D、Cd、CdS、CdD、CdSD、CdSM、CdDM和CdDSM）下基因表达的相关性和回归分析。每个图都显示了与各自的回归方程和R平方值的强相关性：HU02G02539_WRKY（y=0.7173x+2.1388，R=0.8350），HU01G05984_WRKY（y=0.9507x+1.0864，R=0.8026），HU07G00854_NAC（y=0.9849x+1.0367，R=0.9711），HU03G00886_MYB（y=0.914x+0.7484，R=0.9545）和HU01G00293_bHLH（y=0.9793x+1.1094，R=0.9277）。该图比较了五个基因的RNA-seq和qRT-PCR分析的log2倍变化。缩写：控制（Ck）；褪黑素（M）；盐度（S）；干旱（D）；镉（Cd）；镉+盐度（CdS）；镉+干旱（CdD）；镉+盐度+干旱（CdSD）；镉+盐度+褪黑素（CdSM）；镉+干旱+褪黑素（CdDM）；镉+干旱+盐度+褪黑素（CdDSM）。

3.讨论

3.1.褪黑素增强胁迫对植物生长性能的影响

与其他单一胁迫相比，镉暴露对火龙果幼苗的生长表现出最明显的不利影响。对与火龙果有一些相似之处的光果芸香幼苗的研究表明，通过添加氮可以减轻镉的负面影响。这项研究表明，氮可以促进根系发育和整体生物量，从而减轻镉对植物生长的不利影响[20,21]。此外，对芦苇的研究表明，镉以剂量依赖的方式阻碍发芽和早期幼苗生长，这表明在类似条件下可能对火龙果有类似的影响[22]。

当与S或D结合时，Cd胁迫进一步抑制了生长，特别是在Cd和S的组合中。然而，M的应用减弱了这些多因素胁迫对火龙果幼苗的影响，除非同时存在Cd、S和D。枝状体长度、直径以及茎和根的大小等形态参数的显著减少突显了这些胁迫的严重性（图1）。尽管在复合胁迫下镉积累增加，但施用M抵消了这些负面影响并促进了生长。这些发现与之前的研究一致，表明镉对植物生长具有强大的抑制作用。对小型水生植物欧亚无根萍的一项研究表明，用M预处理显著提高了光合色素、蛋白质和单糖的水平，减少了镉的毒性作用。这种作用在同时用25μM的M和镉处理的植物中尤为明显，突显了M减轻镉对植物生长不利影响的潜力[23]。另一项关于硅和M在镉胁迫条件下对玉米的联合影响的研究表明，这种协同作用显著改善了植物高度和茎直径等生长参数，也减少了镉的积累，进一步强调了其对镉毒性的保护作用[24]。此外，M处理已被证明可以通过增强植物的固有保护机制来减轻镉、维生素D和S胁迫的不利影响[25]。了解控制植物对复合胁迫反应的分子机制至关重要。在所有分析的胁迫条件下，识别出141种常见的DEG，主要与重金属耐受性有关，这就是例证。在镉胁迫下的番茄植株中，观察到显著的转录改变，包括根中1123个DEGs和茎中159个DEGs的表达。在对抗氧化胁迫的关键途径中，如谷胱甘肽和S代谢，表达丰富。这些发现强调了植物在镉胁迫下所采用的复杂调控网络[26]。在结缕草（一种具有潜在植物修复能力的草坪草）中，镉暴露后的转录组分析显示，随着时间的推移，存在5321至6526个DEGs，表明对镉的反应具有强大的基因调控[27]。

3.2.单一和多重胁迫的共同和独特转录组响应及相互作用

白心火龙果在不同胁迫条件下的转录组分析揭示了不同和重叠的DEG对单、双和多因素胁迫处理的反应。当受到D、M和Cd等单一胁迫条件时，我们识别出3805个独特的DEG和141个常见的DEG。值得注意的是，HU04G00348、HU02G00171和HU07G00210在干旱胁迫下显著上调，突显了它们在蛋白质降解、渗透调节和胁迫信号传导中的作用，这对维持细胞稳态和适应缺水至关重要。这与之前的研究一致，这些研究强调了这些过程在其他植物物种干旱胁迫反应中的重要性[28,29]。

同时，HU04G00192和HU05G01710在金属胁迫下表现出独特的表达模式，强调了它们参与褪黑素调节机制。HU02G03171仅对S胁迫有反应，而HU02G02576对镉暴露有特异性反应。这些发现与先前的研究一致，表明褪黑素在调节胁迫反应和增强植物对非生物胁迫的耐受性方面起着关键作用[30]。

在双胁迫处理（CdS和CdD）中，我们观察到了独特和常见的DEG。HU09G01164在CdS处理下独特地上调，突显了其在金属和盐度胁迫联合反应中的特殊作用。有趣的是，HU09G00269和HU10G00959通常在CdS和CdD下受到调节，这表明存在整合对金属和非生物胁迫反应的共享途径，并表明存在一种趋同的调节机制，其中某些基因在介导对多种胁迫因素的反应中起着关键作用。拟南芥中也有类似的整合反应，在复合胁迫条件下，共同的信号通路被激活[31]。

多因素治疗使表达模式进一步复杂化。例如，在CdSvsCdDSM和CdDvsCdDM等治疗中，HU06G00171表现出差异表达，表明当多种胁迫结合时存在复杂的调控机制。HU05G01506在CdS和CdSM中的表达不同，说明了胁迫反应的多面性。此外，HU10G03180被确定为所有多因素治疗中常见的DEG，强调了其在综合胁迫反应中的关键作用。这些结果与其他植物物种的发现一致，在这些物种中，复杂的调控网络被激活以应对多因素胁迫[32]。

我们的研究结果强调了白火龙果不同胁迫反应之间错综复杂的相互作用。基因HU04G00348、HU02G00171和HU07G00210表现出胁迫特异性表达，而其他基因，如HU09G00269和HU10G00959，则参与了一个共同的调控网络。这突显了植物为适应不同和组合的环境挑战而保持的复杂平衡。先前的研究也指出了这种监管网络在确保植物在不同环境条件下存活方面的重要性[33,34]。

这突显了植物为适应不同和组合的环境挑战而保持的复杂平衡。

3.3.复合胁迫条件下火龙果抗氧化活性增强

本研究阐明了经受单一和组合胁迫处理的植物的显著生化变化，揭示了组合胁迫通常比单一胁迫诱导更强的生化反应，反映了对植物胁迫生理的协同效应（图3）。在所有胁迫处理中观察到的H₂O₂含量的增加表明氧化胁迫反应增强。M处理表现出最高的增加，与对照组相比增加了175%。单一胁迫（Cd、S和D）分别增加了50%、100%和125%，而组合胁迫（CdS和CdSD）导致增加了150%。这些发现与之前的研究一致，表明联合胁迫治疗比个体胁迫更能加剧氧化胁迫，这与胁迫条件下ROS产生的增强是一致的[35]。APX活性是一种关键的抗氧化酶，在S和D处理中显著升高，与对照组相比分别增加了185%和200%。复合胁迫，如CdSD，导致85%的增加。压力条件下APX活性的升高与其在H₂O解毒和减轻氧化损伤方面的作用是一致的，正如Mittler（2017）之前报道的那样[36]。POD活性遵循与APX相似的模式，在S和D处理中观察到最高水平，与对照组相比分别增加了150%和160%。复合胁迫（CdS和CdSD）显示POD活性增加，分别上升了120%和110%。这些结果表明，在复合胁迫条件下存在增强的抗氧化防御机制，证实了[37]的发现。对照植株CAT活性最高。单一胁迫（S和D）分别使CAT活性显著降低了80%和60%。然而，复合胁迫（CdS和CdSD）分别将CAT活性保持或略微提高了20%和15%。这表明，正如Gill等人（2010）[38]的研究所观察到的那样，虽然单一压力严重影响CAT活性，但复合压力可能会诱导补偿机制来维持CAT水平。与对照组相比，S和D处理组的SOD活性分别提高了57%和71%，在CdSD等复合胁迫下甚至更高，增加了86%。SOD是抵抗ROS的第一道防线，在减轻氧化损伤方面起着至关重要的作用，其在胁迫条件下的活性增加就证明了这一点[39]。已知的渗透保护剂脯氨酸含量在S处理中明显较高，与对照组相比增加了175%。复合胁迫（CdS、CdSD和CdSM）分别使脯氨酸水平进一步提高了138%、150%和125%。胁迫条件下脯氨酸的积累有助于稳定蛋白质和膜，这表明在复合胁迫下保护反应增强，与[40]的研究结果一致。这项研究的结果表明，与单一胁迫相比，联合胁迫治疗会加剧氧化胁迫，并激活更强大的抗氧化防御机制。

3.4.参与对单一和组合胁迫反应的转录因子

在我们的研究中，发现属于WRKY、MYB、NAC和bHLH家族的几个转录因子在浅橙色模块内共表达，表明在胁迫条件下基因网络内存在复杂的相互作用。先前的研究阐明了这些转录因子在植物胁迫条件下的复杂相互作用。值得注意的是，浅橙色模块内WRKY、MYB、NAC和bHLH转录因子的共表达与植物中的类胡萝卜素合成有关。这些转录因子是通过WGCNA鉴定的，并与类胡萝卜素表达显著相关，强调了它们在胁迫反应和代谢途径中的关键作用[41]。它们的结构特征，如WRKY结构域和锌指状基序，有助于特定的DNA结合，从而调节对胁迫有反应的基因[42]。在马铃薯中，共表达和差异表达的分析突出了不同转录因子家族（WRKY、MYB、bHLH和bZIP）在热、盐和干旱等非生物胁迫下的反应，特定转录因子在某些条件下表现出高水平的表达[43]。面包小麦分析涉及全基因组分析和胁迫条件下的miRNA靶向，在这些家族中鉴定出许多TFs对非生物胁迫的反应[44]。对杨树物种在多种非生物胁迫下的研究表明，WRKY、MYB和bHLH家族的TFs显著上调，增强了转基因系的胁迫耐受性[45]。对拟南芥的研究表明了WRKYTF在调节S胁迫反应中的作用，特别强调了WRKY8及其相互作用伙伴在耐受盐度胁迫方面的拮抗作用[46]。

在这项研究中，包括WRKY75、WRKY28和WRKY27在内的8个WRKY基因在浅橙色模块内表现出高度的连接性，这表明它们在应对单因素和多因素胁迫条件方面发挥着关键作用。一项关于拟南芥的研究表明，WRKY25、WRKY26和WRKY33通过调节热诱导基因在高温下的转录变化来协同诱导耐热性[47]。进一步的研究强调了拟南芥中含有的线粒体蛋白酶FtSH4在调节WRKY依赖性水杨酸积累和信号传导中的作用，从而影响叶片衰老和防御机制[48]。在拟南芥的未折叠蛋白反应和免疫调节中，已经记录了涉及WRKYTF和其他TF类型（如bZIPs）的复杂调控网络，从而加深了我们对WRKY如何影响更广泛的生理和防御反应的理解[49]。例如，在渗透胁迫和盐胁迫的初始阶段，发现PagWRKY75被下调，过表达PagWRKY75%的转基因杨树品系对这些胁迫表现出更高的敏感性[50]。

来自蓝色模块的15个TFs属于WRKY、NAC、MYB、bHLH和bZIP家族，被识别为中枢基因，在胁迫条件下表现出增强的表达（图7）。番茄全基因组分析强调了WRKY和bHLH转录因子在镉胁迫反应中的作用，为它们在胁迫反应途径中的调节功能提供了见解。这可能包括盐和干旱等综合压力[51]。此外，对多种非生物胁迫下植物中各种转录因子的作用进行了全面综述，讨论了这些转录因子如何与细胞成分相互作用以调节胁迫反应，这对开发耐胁迫植物品种至关重要[52]。一项关于小麦TFs的详细研究探讨了它们在非生物胁迫下的不同表达模式，强调了WRKY、MYB和bZIP等家族在管理复合胁迫条件中的功能重要性[53]。

3.5.单一和复合胁迫下的植物激素信号

在镉胁迫下，IAA4基因显著上调，表达增加了7.24倍。相反，在相同条件下，ABP19B基因显著下调了11.98倍。这项研究还强调了镉暴露期间脱落酸（ABA）合成与ABA8和羟化酶CYP707A2a基因下调的关系。这些显著变化伴随着植物ABA水平的增加，在单因素和多因素胁迫反应中都至关重要。在ABA合成途径中，吲哚-3-乙酸（IAA）被确定为一种关键的限速酶[54]。ABA是一种内源性信号，介导植物的非生物胁迫反应，AtIAA4参与种子发育过程中ABA的生物合成[55]。

此外，该研究观察到在胁迫条件下乙烯生物合成基因的不同反应。一个ACC合酶（ACS）基因上调，而两个ACC氧化酶（ACO）基因的表达也增加，但三个ACS基因下调。目前，尚不清楚D压力是否会导致乙烯水平的增加或减少。众所周知，乙烯在植物的各种发育过程和胁迫反应中起着重要作用[56]。值得注意的是，与对照植物相比，处于D胁迫下的植物，如菠萝，在叶片和茎组织中产生的乙烯明显较少[57]。这些不同的发现表明了物种对压力的特异性反应。一般来说，D胁迫期间ACC生物合成的变化会影响乙烯的产生。乙烯反应因子（ERF）是乙烯信号通路的下游元件，在植物对非生物胁迫的反应中至关重要[58]。

此外，这项研究发现，两个油菜素内酯LRR受体激酶（BRL）基因在单一和双重胁迫下的表达增加，表明其对非生物胁迫具有潜在的防御作用。众所周知，BR和ABA介导植物对非生物胁迫的反应，最近的研究表明，BR在调节对单一、双重和多因素胁迫的反应中发挥作用[59]。BR和ABA信号通路之间的相互作用显示出拮抗作用，其中BR被认为可以减轻对胁迫的反应，而ABA则可以增强它们[60]。研究表明，拟南芥可以通过过度表达BR家族富含血管的成员BRL2来发展抗旱性，而不需要正常生长[61]。这些发现强调了研究模型植物中激素相互作用的重要性，以更好地了解它们在胁迫耐受中的作用，特别是在火龙果等物种中。这项研究不仅揭示了胁迫条件下的激素动力学，而且为植物单因素和多因素胁迫反应中激素之间的相互作用奠定了基础。

3.6.单一和复合胁迫下的植物激素信号

本研究调查了白火龙果（）在各种胁迫条件下的转录反应，揭示了涉及D、M、S和Cd暴露的单一胁迫处理中3805个独特的DEGs和141个常见的DEGs。关键基因，如HU04G00348、HU02G00171和HU07G00210，在D胁迫下显著上调，表明其在蛋白质降解、渗透调节和胁迫信号传导中的作用，这对在缺水期间维持细胞稳态至关重要。在M（HU04G00192、HU05G01710）、S（HU02G03111）和Cd暴露（HU02G2576）中鉴定出独特的DEG，突出了特定的调控机制。这些发现表明，白火龙果利用一系列复杂的基因来管理不同的胁迫条件。在干旱胁迫条件下，HU04G00348、HU02G00171和HU07G00210的上调突显了它们在维持细胞稳态和适应缺水方面的重要性。褪黑素、盐度和镉胁迫下观察到的独特表达模式指向了专门的途径，这些途径在这些胁迫下被激活。先前的研究记录了特定基因在其他植物物种的非生物胁迫反应中的作用[62]。我们的发现与这项工作相一致，但也通过鉴定参与白火龙果对复合胁迫条件反应的新基因来扩展它。例如，在镉和盐度共同胁迫下，HU09G01164的独特上调表明了其在管理金属和盐度胁迫方面的新作用。这项研究对农业实践和作物改良策略具有重要意义，为开发具有抗逆性的白火龙果品种提供了实际效益。

3.7.信号通路介导单一和组合胁迫反应

在这项研究中，我们分析了不同胁迫条件下的基因表达。具体来说，6个基因在S胁迫条件下上调，2个在M处理期间上调，3个在干旱D胁迫条件下下调，7个在Cd胁迫期间上调，两个在Cd和D复合胁迫期间下调，4个在S胁迫下下调。M处理结合Cd、S和D胁迫的应用揭示了CaM/CML的参与。CML35、CML39、CML48、CML42、CML44、CML41、CML18和CML13等基因的表达变化尤为明显。有趣的是，编码CML13和CML49的基因被下调。

我们的发现与先前的研究一致，表明CDPKs/CPKs在几种胁迫信号通路中起着关键作用。值得注意的是，D和S胁迫下调了AtCML8、AtCML13、AtCML118和AtCML25等基因[63]。此外，据报道，在冷、D和S胁迫条件下，ShCML44基因在西班牙鼠尾草中的表达升高。HuERF1基因在火龙果植物中的过表达已被证明具有有益作用。特别是，它有助于提高抗氧化活性，并通过在盐胁迫下调节活性氧（ROS）水平来提高耐盐性。这意味着不同类型的压力可能具有相似的反应机制[64]。

干旱条件下的转录组分析显示火龙果激素介导的信号通路发生了显著变化。此外，这项研究确定了生长素和乙烯信号通路之间的复杂相互作用[65]。一些研究强调，需要复杂的生理和生化机制来确保火龙果的耐旱性，通过鉴定许多有助于D反应的DEG[66]。此外，研究结果揭示了植物内部相互关联的胁迫反应网络，因为镉暴露会影响其他胁迫反应途径中涉及的基因的表达[67]。

我们的研究还表明，在单因素、双因素和多因素胁迫下，编码推定钙依赖性蛋白激酶的六个基因上调。其中四个基因在S、D、Cd胁迫以及Cd、S和D与M的联合处理期间表现出高表达水平。这些发现表明，在单因素和多因素处理下，AtCBP和ALA信号通路都显著激活。有趣的是，发现编码CBP的三个基因在S、D以及Cd和S胁迫与M处理的组合条件下显著下调，这表明CBP信号通路在管理的非生物反应中发挥了作用。

上述结果强调了钙介导的信号通路在对单一和多因素胁迫反应中的关键作用。拟南芥的非生物胁迫耐受性是由AtCBP和ALA的过表达赋予的，正如一项研究[68]所证明的那样。另一方面，AtCBP1作为渗透反应的负调节因子发挥作用，强调了这些途径的重要性。研究表明，不同的钙依赖性蛋白激酶对于增强对S和D胁迫的耐受性至关重要[69]。此外，广泛的转录组分析表明，在胁迫条件下，许多基因要么上调要么下调，这有助于植物的整体胁迫管理策略[70]。

3.8.单一和复合胁迫的代谢反应

我们的研究表明，是一种通过调节代谢对各种刺激有强烈反应的物种。我们注意到，渗透防护物质产量的增加对于提高植物对恶劣环境条件的抵抗力至关重要。脯氨酸是一种氨基酸，在渗透保护中起着至关重要的作用，有助于在植物受到渗透胁迫时促进生长。在这个过程中，这种氨基酸通过不同的酶途径转化为不同的分子[71]。为了忍受这种条件，衣藻显著提高了复杂脂质的合成并改变了其脂肪酸谱[72]。此外，更高水平的二氧化碳可以作为CAM植物（如火龙果和大花蛇鞭柱）的一种环境胁迫形式，导致碳同化和发育增强，表明啮齿动物的糖和潜在淀粉产量增加，以适应环境波动[73]。

此外，与脂质生物合成相关的基因，特别是长链酰基辅酶A合成酶（LACS）家族的基因，在胁迫条件下表现出不同的表达。例如，在Cd和D胁迫以及镁（M）处理下，LAC3和LAC12被诱导，而在S和Cd胁迫下，几个LACS基因被下调。这突显了脂质代谢在适应压力条件中的关键作用，与Chromochloriszofingiensis的发现相一致，该发现为LACS在压力下脂质代谢中的功能提供了见解[74]。

次生代谢在植物在非生物和生物胁迫下对环境的适应中也起着重要作用。苯丙烷途径对各种非生物胁迫（包括热浪和干旱）特别敏感，在这方面至关重要。在白葡萄（VitisviniferaL.）中，该途径在干旱胁迫下的激活涉及编码香豆酸辅酶A连接酶（4CL）和苯丙氨酸解氨酶等酶的基因的显著调节，这些酶在黄酮类化合物和其他苯丙烷类化合物的生物合成中至关重要[75]。

我们的研究进一步揭示，单因素和多因素胁迫诱导了编码参与黄酮生物合成的酶的基因的表达，如查耳酮异构酶（CHS）、花青素合酶和黄酮合酶（FLS）。这些酶是黄酮类化合物合成不可或缺的一部分，黄酮类化合物在紫外线防护和抗氧化防御机制中起着关键作用，可能会增强镉和干旱胁迫等条件下的胁迫耐受性。在小麦中，CHS参与黄酮类化合物生物合成与植物对环境胁迫的适应性反应直接相关，不同同源基因对盐度胁迫的转录反应各不相同[76]。

此外，研究表明，花青素合酶对花青素的生物合成有显著贡献，花青素是一种通过清除自由基和增强胁迫耐受性来保护植物免受各种胁迫的色素[77]。通过FLS等酶调节类黄酮合成在胁迫条件下至关重要，研究表明，BRs信号传导调节类黄酮生物合成中关键酶的表达，说明了生长和胁迫反应之间的权衡，包括UV-B保护[78]。

这些复杂的相互作用突显了植物通过代谢调节和关键途径的转录调控来管理胁迫的复杂机制，强调了遗传和生物技术干预提高作物抗逆性的潜力。

4.材料与方法

4.1.植物材料与胁迫处理及褪黑素的应用

4.2.镉含量的表型和定量

测量了各种形态参数，以评估不同处理对火龙果幼苗的影响。这些参数包括CL、CD、SL、SW、RL和RW。使用由浙江拓捷仪器有限公司（中国绍兴）开发的石墨消化装置（GY-25），使用所建立的方法对火龙果芽和根中的CD含量进行定量。

4.3.RNA提取、cDNA文库构建和测序

使用RNAprep纯总RNA提取试剂盒（中国北京天根）从0.5克火龙果枝中提取总RNA。从11个处理中获得了新出现的茎（枝）和叶的样本。从所有收集的样品中提取RNA，并使用安捷伦2100生物分析仪（美国加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司）评估RNA的质量和完整性。为了去除基因组DNA污染，根据试剂盒说明，用DNaseI处理每个样品中的1μgRNA，然后使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen，中国上海）生成cDNA。RNA文库是使用NEBNextIlluminaUltraRNA文库制备试剂盒（NEB，Ipswich，MA，USA）制备的。使用IlluminaNovaSeq6000（Illumina，USA）和来自中国北京有限公司的S4试剂盒组分进行RNA测序。RNA-seq数据以生物项目登录号PRJNA1121504保存。

4.4.从头组装和注释

原始测序数据最初以FASTQ格式给出，使用具有默认参数的NGSToolkit（版本2.3.3）进行处理。为了确保数据的可靠性和清洁度，从原始数据中过滤出包含适配器、poly-Ns或低质量读取的序列。使用Song等人（2019）[80]描述的Trinity方法对高质量数据进行从头组装，从而产生了单基因。

4.5.差异基因表达（DEGs）的鉴定

在过滤掉低质量的读数后，Illumina测序读数与参考基因组进行了比对（可在（访问））使用具有默认参数的HISAT[81]。生成的包含唯一映射读取的BAM文件用作HTSeq的输入。基因表达水平使用FPKM（每千碱基转录本每百万映射读取片段数）方法进行定量[82]。为了确定标准化表达水平，应用log2（FPKM+1）转换，并计算生物重复之间的Pearson相关系数。基于Konishi（2016）[83]描述的方法，使用Cuffdiff工具识别DEG，其log2倍变化（FC）阈值和错误发现率（FDR）≤0.05。

4.6.DEGs的富集分析

根据Ye等人（2019）[84]描述的方法，GOseq用于识别重要模块中基因DEGs的重要GO项（）。R中的聚类分析器包用于对DEGs进行KEGG富集分析，显著性水平为。

4.7.与治疗相关的Hub基因和子网络的鉴定

使用的CytoNCA插件确定与中心性值最高的前25%基因有强连接的中心基因。使用了中心性度量，如中心性之间（BC）、亲密中心性（CC）和程度中心性（DC）。STRING数据库用于构建蛋白质相互作用网络，置信度阈值设置为0.4。在DEGs中鉴定出对各种治疗有反应的Hub基因。用于识别DEGs网络中的子模块[85]。使用R中的加权基因共表达网络分析（WGCNA）（）软件包进行共表达网络的分析[86]。

4.8.酶活性测定

为了评估酶活性，将0.5g植物样品在pH为7.8的5mL50mMPBS中研磨[87]。然后在4°C下以10000RPM的速度离心样品10分钟。抗氧化酶活性、H2O2含量和渗透调节物质使用有限公司美智生物医药科技有限公司提供的试剂盒进行测定。使用WST-8法测量超氧化物歧化酶（SOD，M0102A）的活性[88]，使用愈创木酚法评估过氧化物酶（POD，M0105A）的活动[89]，使用紫外吸收法测量过氧化氢酶（CAT，M0103A）的活跃[90]，还使用紫外吸收法测量抗坏血酸过氧化物酶（APX，M0403A）的活力[91]。通过S酸钛法测定H2O2含量[92]。此外，使用茚三酮法测量脯氨酸含量[93]，使用BCA法测量蛋白质含量[94]。所有测定均按照制造商的说明进行，不同抗氧化剂的值，包括SOD、CAT、APX、PRO、POD和H2O2，分别在450、240、340、412、520、470、450和340nm的波长下计算。

4.9.RNA提取和qRT-PCR

根据制造商的说明，使用RNAprep纯植物试剂盒（中国北京天根）从植物材料中提取总RNA。使用每个处理组（包括单组和联合组）的叶子或枝进行RNA提取。按照之前描述的方法，将每个重复的三个样本合并，以产生RNA提取物[95]。使用2^ΔΔCT方法[96]进行数据分析，该方法通过比较靶基因和参考基因的表达来准确量化基因表达。肌动蛋白基因（）被用作内部对照，引物序列为HuActin-F:AAAGGCTAACAGGGAGAAAA和HuActin-R:GACCACTGGGTAGAAGAA。在之前的研究中，该基因已被证实是一种稳定的内部控制[97]。本研究中使用的引物见补充表S14。

4.10.统计分析

使用（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司），通过方差分析和邓肯检验进行统计分析，显著性水平≤0.05。三个生物重复的平均值±标准差用于描述数据。

5.结论

在这项研究中，转录组分析为理解火龙果的胁迫反应基因提供了重要资源。它揭示了细胞对单一、双重和多因素胁迫的各种反应，突出了植物对重金属水平升高的特定或拮抗反应的需求，无论是单独施用还是与其他非生物胁迫结合施用。值得注意的是，镉暴露抑制了火龙果的生长，影响了茎和枝的发育，当与D和S胁迫结合时，其不利影响会加剧。这些综合胁迫因素协同增强了彼此的影响，特别是当Cd、D和s同时存在时。有趣的是，与S和D的组合相比，Cd与M的组合对生长的影响较小。然而，Cd、S和D的组合胁迫严重损害了火龙果，显著增加了Cd的吸收。研究表明，盐度可以通过增加蒸腾作用和气孔开度来增强镉的吸收，从而促进镉的吸收。本研究成功绘制了基因调控网络图，并鉴定了与非生物胁迫耐受性相关的转录因子，加深了我们对对各种胁迫反应的理解。转录组数据表明，包括离子通道蛋白在内的信号受体在非生物胁迫下通过钙（Ca2+）、ROS和植物激素途径感知和传递信号中起着关键作用。这些信号由蛋白质磷酸化酶和激酶传递，激活对细胞稳态至关重要的转录因子，并触发对S、D和Cd胁迫（包括脂质、碳水化合物和次生代谢）有反应的下游基因转录。WGCNA确定了与火龙果单因素、双因素和多因素胁迫反应相关的中枢转录因子。此外，本研究还确定了M在减轻火龙果胁迫效应方面的重要作用。我们发现M调节基因表达并增强胁迫耐受性，突出了其作为提高非生物胁迫抗性的关键因素的潜力。我们的研究结果表明，进一步探索这些生理和遗传机制，以及它们与其他胁迫相关途径的相互作用，可能会导致提高不同植物对环境胁迫的抵抗力的有效策略。

团队在热带水果育种方面的代表性论文：

1.ZamanQU,LHui,MFNazir,GWang,VGarg,MIkram,ARaza,WLv,DKhan,AAKhokhar,ZYou,AChitikineni,BUsman,CJianpeng,XYang,SZuo,PLiu,SKumar,MGuo,ZXZhu,GDwivedi,YHQin,RKVarshney*,HFWang*.Chromosome-levelgenomeassemblyofautotetraploidSelenicereusmegalanthusandgaininggenomicinsightsinto:.[Top期刊，IF:10.1，按照发表时的分区和影响因子，下同].

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8.Khokhar,;Hui,L.;Khan,D.;You,Z.;Zaman,;Usman,B.;WangHF*.TranscriptomeProfilesRevealKeyRegulatoryNetworksduringSingleandMultifactorialStressesCoupledwithMelatoninTreatmentinPitaya(SelenicereusundatusL.).,25,8901.[中科院二区，IF:4.9].

9.Zaman,,Garg,V.,Raza,A.,Nazir,,Hui,L.,Khan,*(2024)Uniqueregulatorynetworkofdragonfruitsimultaneou,176(4),e14416.[中科院二区，IF:5.4].

期刊：

文章标题：TranscriptomeProfilesRevealKeyRegulatoryNetworksduringSingleandMultifactorialStressesCoupledwithMelatoninTreatmentinPitaya(SelenicereusundatusL.).

作者信息：AamirAliKhokhar1,2,LiuHui1,2,DaryaKhan1,2,ZhangYou1,2,,2,BabarUsman1,2,*andHua-FengWang1,2,*