LC3双荧光自噬慢病毒的应用（下篇）——数据分析及实验小Tips

上一期们介绍了LC3双荧光自噬慢病毒的实验原理及病毒使用，那么后续实验数据如何处理？操作中有哪些小技巧及注意事项呢？今天就跟小编一起挖掘一下吧~

（一）结果判定标准

1、诱导处理

a)红/绿色共定位的点状聚集（黄色斑点）：早期自噬小体的生成；

b)绿色荧光淬灭，只有红色斑点聚集：自噬晚期自噬溶酶体的形成。

2、抑制处理

a)感染野生型LC3的实验中黄色和红色斑点数量都下降：自噬流在早期被抑制；

b)黄色上升，红色下降：自噬流在晚期被抑制。

总结成自噬流的判定标准如下表所示：

自噬流变化

本底

自噬流发生

早期抑制

晚期抑制

Red+Green+(黄色斑点）

-

上升

下降

上升

Red+Green-(红色斑点）

_

上升

下降

下降

（二）数据分析

CON

感染自噬慢病毒，加溶剂处理的细胞

CON+Rapa

感染自噬慢病毒，加100nM终浓度的Rapa处理细胞

NC

感染自噬慢病毒,再加入阴性对照慢病毒感染的细胞,分别在细胞贴壁后6H检测

OE

感染自噬慢病毒,再加入目的基因过表达慢病毒感染的细胞，分别在细胞贴壁后6H检测

Averagedotscountpercell：红色荧光及绿色荧光各组的平均荧光值：

RelativedotsCountRed/Green：红色荧光与绿色荧光强度的比值：

相比CON，加入Rapa后自噬体明显增多，自噬流向自噬溶酶体流动，RelativedotsCountRed/Green升高(和预实验结果相符），P小于0.05。证明本次实验结果可信。

相比NC组，OE组3个时间点的RelativedotsCountRed/Green无明显变化，P大于0.05。提示该基因可能对Siha细胞自噬体向自噬溶酶体的流动无明显作用。

（三）关于实验小Tips

Q

为何细胞感染自噬慢病毒后各个组别

均有自噬体产生？

A：细胞自噬属于正常的细胞生理活动，在饥饿的情况下也会有大量的自噬现象发生，故在培养过程中，注意更换新鲜培养基、维持细胞密度在80％左右，保证细胞营养充分。

Q

感染后的细胞是否可以直接用于

自噬诱导？

A：自噬慢病毒感染后，由于慢病毒以及感染试剂对细胞有—定的毒性，细胞需要—定的适应时间，并且慢病毒感染后，细胞中荧光标记蛋白表达还不稳定，不能很准确的判断感染效率，故不建议用刚刚感染的细胞进行自噬诱导。一般感染后4天，荧光标记蛋白表达较稳定，细胞状态稳定，可以安排后续自噬诱导

Q

自噬慢病毒已经占据绿色荧光及红色荧

光两个通道，细胞核染色后也会占据蓝

色通道，如果想进行基因调控是否可以

再带其他颜色的荧光呢？

A：一般做自噬流检测我们不建议细胞再带其他颜色的荧光，例如是做基因敲减，有三种解决方案：

1）建议将目的基因shRNA构建在自噬载体上（该载体已经带有红绿荧光），那么进行自噬慢病毒感染即可，该方案的优点是只感染一次病毒，操作简便，缺点是重新构建载体可能会导致更高的成本；

2）选择其他的方式（如真核抗性筛选）建立好目的基因敲减稳定株后，再进行自噬慢病毒的感染，由于LC3自噬慢病毒本身带有嘌呤霉素puromycin抗性，因此建议选择其他真核抗性，如新霉素或潮霉素抗性等，这种方案将需要进行两次慢病毒感染（一次对基因调控建立稳定株，第二次感染LC3自噬慢病毒监测自噬流）；

3）选择其他颜色的荧光，如青色荧光，由于很多荧光都是由绿色和红色为基础衍生而来，并且激发光与发射光直接的重叠也可能会发生影响，后续荧光颜色太多，也可能造成相互的干扰，因此存在一定的风险，下面小编列举了常见荧光的激发光以及发射光波长，给大家参考，选择技巧是尽量保证激发波长直接的距离远一些、不要有重叠，同时，第一种荧光的发射波长不会达到第二种荧光的激发波长：

荧光蛋白名称

激发波长

（nm）

发射波长

（nm）

光量子

结构

相对亮度

（EGFP的百分比）

GFP(wt)

395/475

509

0.77

单体

48

绿色荧光蛋白

EGFP

484

507

0.6

单体

100

Emerald

487

509

0.68

单体

116

SuperfolderGFP

485

510

0.65

单体

160

AzamGreen

492

505

0.74

单体

121

mWasabi

493

509

0.8

单体

167

TagGFP

482

505

0.59

单体

110

TurboGFPGFP

482

502

0.53

二聚体

102

AcGFP

480

505

0.55

单体

82

ZsGreen

493

505

0.91

四聚体

117

T-Sapphire

399

511

0.6

单体

79

蓝色荧光蛋白

EBFP

383

445

0.31

单体

27

EBFP2

383

448

0.56

单体

53

Azurite

384

450

0.55

单体

43

mTagBFP

399

456

0.63

单体

98

青色荧光蛋白

ECFP

439

476

0.4

单体

39

mECFP

433

475

0.4

单体

39

Cerulean

433

475

0.62

单体

79

CyPet

435

477

0.51

单体

53

AmCyan1

458

489

0.24

四聚体

31

Midori-IshiCyan

472

495

0.9

二聚体

73

TagCFP

458

480

0.57

单体

63

mTFP1(Teal)

462

492

0.85

单体

162

黄色荧光蛋白

EYFP

514

527

0.61

单体

151

Topaz

514

527

0.6

单体

169

Venus

515

528

0.57

单体

156

mCitrine

516

529

0.76

单体

174

YPet

517

530

0.77

单体

238

TagYFP

508

524

0.6

单体

118

PhiYFP

525

537

0.39

单体

144

ZsYellow1

529

539

0.42

四聚体

25

mBanana

540

553

0-7

单体

13

橙色荧光蛋白

KusabiraOrange

548

559

0.6

单体

92

KusabiraOrange2

551

565

0.62

单体

118

mOrange

548

562

0.69

单体

146

mOrange2

549

565

0.6

单体

104

dTomato

554

581

0.69

二聚体

142

dTomato-Tandem

554

581

0.69

单体

283

TagRFP

555

584

0.48

单体

142

TagRFP-T

555

584

0.41

单体

99

DsRed

558

583

0.79

四聚体

176

DsRed2

563

582

0.55

四聚体

72

DsRed-Express(T1)

555

584

0.51

四聚体

58

DsRed-Monomer

556

586

0.1

单体

10

mTangerine

568

585

0.3

单体

34

红色荧光蛋白

mRuby

558

605

0.35

单体

117

568

592

0.49

单体

109

mStrawberry

574

596

0.29

单体

78

AsRed2

576

592

0.05

四聚体

8

mRFP1

584

607

0.25

单体

37

JRed

584

610

0.2

二聚体

26

mCherry

587

610

0.22

单体

47

HcRed1

588

618

0.015

二聚体

1

mRaspberry

598

625

0.15

单体

38

dKeima-Tandem

440

620

0.24

单体

21

HcRed-Tandem

590

637

0.04

单体

19

mPlum

590

649

0.1

单体

12

AQ143

595

655

0.04

四聚体

11