惊！美国草莓核心种脱毒苗生产流程曝光

惊！美国草莓核心种脱毒苗生产流程曝光

1、美国草莓育苗的流程

美国的草莓产业经过上百年的发展，如今在育种、育苗、生产草莓果的各个方面均处于世界领先地位。草莓育苗体系在美国有着严格的流程和认证系统，目前较大的几家草莓苗圃均位于加利福尼亚州境内，认证标准和标志由加利福尼亚州食品和农业局检验检疫和发放。总的来说，美国的草莓育苗是四代种苗、五年生产的体系。详细介绍如下（图1）

图1美国草莓育苗流程图

第一年：核心种（也就是常说的试管苗）(彩图1)来自茎尖的分生组织生长点。取茎尖的母株需要提前在37℃的热处理室中生长3周以上，这样能保证茎尖不带有病毒。经过处理后取茎尖，马上到实验室中做分生组织培养，每个茎尖只能繁殖一棵试管苗，不能扩繁，防止变异。该试管苗称为核心种。

彩图1试管苗（核心种）

第二年：在远离草莓种植的地方建立网室（彩图2），把驯化后的试管苗栽种在隔离的网室中，该网室可以隔绝任何昆虫，特别是蚜虫等，防止携带病毒感染。每个大培养箱只能种植一棵试管苗。而且有专人，经过消毒处理才能进入管理。这个过程每棵试管苗可以繁殖100一200棵子苗。每个培养箱都要取一定数量的苗到实验室检测病菌、病毒，以及DNA。该网室生产出来的草莓苗称为网室原种。网室原种的后代会继续在低海拔完全隔离的苗圃，每100棵种植一个区域，继续繁育，生产出来的草莓苗成为大田原种。

彩图2网室（原种）

\第三年：低海拔苗圃，海拔高度在200m以下。土壤以沙性地为主，夏季雨水少，气温高，种苗收货前一个月左右有足够低温的气候。这个过程每棵种苗可以繁殖100棵左右的子苗，适当抽取一定数量的草莓苗到实验室做病菌、病毒，以及DNA的检测。该低海拔苗圃生产出来的草莓苗称为注册种（彩图3）。

彩图3低海拔苗圃（注册种）

第四年：高海拔苗圃，海拔高度在1500m左右。土壤以沙性地为主，夏季雨水少，同时昼夜温差大，气候凉爽，保证种苗收货前有一定的需冷量，并且花芽分化完成。这个过程每棵注册种可以繁殖50棵左右的子苗，适当抽取一定数量的草莓苗到实验室做病菌、病毒，以及DNA的检测。该高海拔苗圃生产出来的草莓苗称为商品种（彩图4）。

彩图4高海拔苗圃（商品种）

第五年：商品种可以直接用于种植户在日光温室、春秋大棚、露地进行草莓果实的生产（彩图5）。

彩图5果实生产

2、美国草莓脱毒菌（核心种）生产流程

一棵用于工业化生产流程的脱毒苗，倾向于从茎尖分生组织点取材料，通过组织培养的方法来生产。脱毒苗的主要目的是要去除从母株带来的任何病原体，另外恢复植株本来的强壮长势。脱毒苗可以比常规繁殖的母株繁育更多的子苗。

一、茎尖植株的生产

茎尖植株指的是来自一个茎尖经组织培养长成一棵植株，生产茎尖植株为的是脱除植物材料中的病毒并复壮。与传统繁殖的植株相比，茎尖植株可以产生更多的子苗。

一个茎尖由茎尖组织和1-2个叶原基组织构成，大小为0.4～0.5mm，茎尖组织位于幼嫩的生长点处，幼嫩的生长点可以不断分裂，但尚未分化成叶、茎或其他器官。

下面的步骤介绍了草莓茎尖植株的培养过程（图2），从母株到营养钵中的茎尖植株大约需要一年的时间。

1.母株加利福尼亚大学育种者在推出其品种成为母株之前，需要重复试验多年，而且需要把最初的草莓植株材料提供给美国植物科学基金会(FPS)，母株在全年采用传统的匍匐茎方式生产。

2．每年的病毒检测为了保证苗木具备认证时的性状，每个品种的母株每年都需要进行病毒检测，按照加利福尼亚州食品和农业局注册和认证程序，采用草莓指示植物和草本寄主的方法检测，通过PCR技术对病毒和其他致病菌进行检测。

图2美国草莓茎尖植株的培养过程

3．DNA鉴定为了保证纯度，用DNA指纹标记技术检測需要取茎尖母株的品种纯度。

4．热处理把长有子株的母株放到热处理室，在37℃恒温，70%相对湿度，日长16h条件下至少放置3周，这种条件下只有根系良好的健壮植株才能成活。

5．组织培养从根茎的顶芽和侧芽上切下茎尖，如果去除外围叶片时仔细，表面可以不消毒。用8~100倍变焦立体显微镜在层流气流罩下，无菌环境用手术刀片和镊子切下每个茎尖，）f片和镊子通常用火焰消毒，茎尖取下后轻轻地放到1/2MS培养基(1/2MS，2%蔗糖，1mg/LIAA，0.6%琼脂，）上，在培养基上可以长出茎和根系。发根后外植体大约1cm高时，将试管苗转移到不含生长激素的保存培养基（MS，3%蔗糖，2%琼脂，）上，隔4-8周将幼苗转移到新鲜培养基上。

发往加利福尼亚州以外和其他国家的植株常采用离体（试管）运输方式，苗圃可以选择购买试管苗，或把试管苗种在FPS的田里并安排采苗。植株可以在MS培养基上贮存，用封口膜(Parafilm)，包裹4℃下保存1-2年。

在1/2MS培养基上，我们发现植株不产生或产生很少的愈伤组织。这使产生变异植株的风险降低到最小。Sobczykiewicz(1979)在类似培养基上得到相似结论。如果在试管里或田地中生长的小苗出现花斑或白条纹，要把这些小苗扔掉。

茎尖能否成功成苗取决于品种和技术人员的技能及其他因素。平均成功率为30%-50%，海景品种的成功率只有10%，而卡姆罗莎和阿尔宾品种可高达90~100%。

由于每个子株一般有3-6个茎尖，一个母株有30个子株，这样一个母株可以提供100多个茎尖。FPS组培程序是一个茎尖只产生一株试管苗，这样会使产生变异类型的概率降至最低，因此可以预计每个母株可以产生大约100株试管苗。

母株保存在日光温室中，在换气孔上安装过滤器和防虫网，未经许可禁止人员入内。

每个母株的叶片样品需要烘干进行DNA指纹图谱分析，用于品种纯度鉴定。

6．驯化整齐排列的植株从试管里移栽到5cm口径的营养钵里，钵里装有混合基质，在湿润的气候箱里进行驯化，驯化是至关重要的，需要花费2-3周时间。

7．日光温室试管苗移栽到10cm口径的营养钵中后移入温室，用户购苗前需由加利福尼亚州食品和农业局检测认证。

二、草莓病毒

有30多种病毒和病原体危害草莓，其中许多病毒会显著降低产量，在田间迅速蔓延，但并不表现明显症状。草莓斑驳病毒(SMoV)、草莓皱缩病毒(SCV)、草莓轻型黄边病毒(SIVIYEV)是草莓中最常见的病毒。

SMoV严重发生时能减产30%。当一种病毒侵染时植株可能不表现症状，但多个病毒混合侵染时，生长失调，叶变红，植株变弱，也可能死亡。

在敏感的指示植物上病毒侵染的症状可能表现得很轻或很严重，包括叶片扭曲皱缩、出现花斑或斑点。SMoV、SCV和SMYEV由蚜虫传播；其他病毒包括与甜菜隐黄化病毒有关的草莓灰白症由白粉虱传播；其他类包括番茄环斑病毒(ToRSV)、草莓潜隐性环斑病毒(SLRSV)和甘蓝花叶病毒(ArMV)由线虫传播。

把因病毒侵染造成的损失降到最低的最佳方式之一是种植由加利福尼亚州农业和食品局或类似政府部门认证的健康母株。

三、为什么采用组织培养生产草莓健康母株

在FPS采用组织培养法脱除病毒和其他致病菌，同时可以复壮草莓植株和增加匍匐茎发生量，组培过程中最大限度地避免增殖以降低出现变异体的概率。

20世纪60年代首次报道了通过组培方法脱除草莓病毒，在许多作物上这是一个常用的成功技术。结合热处理，采用组织培养法草莓可以很成功地生产出健康母株。多年来FPS病毒呈阳性的植株经热处理后经检测都转为阴性。

研究和经验表明，即使不做病毒检测，经热处理和组培的植株长势更壮，比传统方法生产出更多的子株。有一种解释是组培后的苗木获得更多的童性，营养生长比生殖生长旺盛，可以预计组培苗比传统苗多出50%的子苗。

一株FPS繁殖的试管苗在隔离温室中一个季节能繁出300~800株子苗，这取决于品种和生长环境；也有报道一株试管苗可繁出2000株子苗，这和传统匍匐茎繁殖相比差异显著，传统苗一个季节只能繁殖100株子苗。

草莓组培扩繁有人接受也有人反对，在FPS不进行扩繁。随着代数的增加它的优点会越来越少，对病虫的抗性会降低。尤其是变异问题，特别是花变异特性已有文献报道、(Jemmali)。通过减少继代培养次数、降低培养基中激素的浓度、组培苗无性繁殖植株的结果试验来防止这一问题的出现。

四、病毒鉴定

每年对每个品种和优系进行15个致病菌的检测。采用三种常规的方法检测：嫁接鉴定、草本寄主检测和PCR技术。这些方法相互补充、互作对照。嫁接和草本寄主能够检测各种病毒，相对便宜。PCR技术速度快、高度敏感，能检测病毒的存在，但是需要昂贵的设备和试剂。

1．嫁接鉴定嫁接鉴定是目前唯一需要CDFA注册和认证的程序，每个供试植株都被看作候选植株，嫁接到两种对病毒敏感的植株上，这两种植物作为草莓病毒的指示植物：森林草莓（UC4或UC5）和弗吉尼亚草莓（UC10或UC11）。

剪下候选植株的叶片，把叶片削成楔形，去除指示植物的中心小叶，劈开叶柄，放入候选植株的小叶，在每株指示植物上嫁接三片小叶，包好叶柄，置指示植物在弥雾条件下使接口愈合。如果候选植株受病毒侵染，大约一个月后指示植物长出的新叶就表现症状。

2．草本寄主鉴定用草本寄主鉴定的原因是汁液传播病毒。采用四种对病毒敏感的草本植物：苋色藜、昆诺藜、小黄瓜和克氏烟，把候选植株的幼叶在缓冲液中研碎，然后把植物浸提液在指示植物上用碳化硅砂摩擦，这样可以把候选植物上存在的病毒粒子传递到指示植物上。

指示植物在温室中培养，如果候选植株受到侵染，大约10--14d后症状会在指示植物上表现。

3．PCR测定候选植株用PCR检测病毒、病原体等。加入相应引物，每个小试管中含有一种植物样品和一种致病菌的PCR反应试剂，放在PCR仪中反应3h。

反应产物注入琼脂糖凝胶中电泳lh。凝胶出现明亮的条带表明测试样品对草莓病毒呈阳性。

五、草莓DNA指纹图谱鉴定

草莓产业中不能单靠一个品种主导市场，所以要不断引进新的草莓品种。加利福尼亚州种植的品种70%来自加利福尼亚州大学戴维斯分校，草莓生产者依靠FPS提供病毒检测后的种苗，栽种最新最好的加利福尼亚大学专利草莓品种。从以往栽培试验来看，一直没有客观地、精确地区别品种的试验，依据产业和消费者的要求，FPS专家开发了DNA指纹技术，可以准确地鉴定草莓品种。

指纹鉴定时，需从草莓鲜叶中提取DNA，然后将指定的标记DNA采用PCR仪进行放大。每个草莓品种放大的标记DNA都是特异的，如同人的指纹一样。通过标记DNA的分析，比较草莓DNA指纹新数据结果，研究者们就能确定草莓品种的纯度。

用来生产组培苗的所有母株都需要进行DNA测定以确定品种的真实性。FPS和美国农业部有机认证(USDA)联合制定了SSR技术方案，形成了一套有效的可靠的DNA指纹技术，并提供给公众。现在可以把草莓样品送到实验室来鉴定它们的纯度，并鼓励苗圃定期检查他们母株的品种纯度。